Diolch i chi am ymweld â Nature.com. Mae gan y fersiwn o borwr rydych chi'n ei ddefnyddio gefnogaeth CSS gyfyngedig. I gael y canlyniadau gorau, rydym yn argymell eich bod chi'n defnyddio fersiwn newydd o'ch porwr (neu'n analluogi Modd Cydnawsedd yn Internet Explorer). Yn y cyfamser, er mwyn sicrhau cefnogaeth barhaus, rydym yn dangos y wefan heb steilio na JavaScript.
Gall darganfod a defnyddio cynhyrchion naturiol yn fuddiol helpu i wella bywyd dynol. Defnyddir cemegau sy'n atal twf planhigion yn helaeth fel chwynladdwyr i reoli chwyn. Oherwydd yr angen i ddefnyddio gwahanol fathau o chwynladdwyr, mae angen nodi cyfansoddion â mecanweithiau gweithredu newydd. Yn yr astudiaeth hon, fe wnaethom ddarganfod cyfansoddyn N-alcoxypyrrole newydd, sef coumamonamid, o Streptomyces werraensis MK493-CF1 a sefydlu'r broses synthesis gyflawn. Trwy asesiadau gweithgaredd biolegol, fe wnaethom ddarganfod bod asid urs-monoamig yn ganolradd synthetig o urs-monoamid ac yn botensial...atalydd twf planhigionYn ogystal, rydym wedi datblygu amrywiol ddeilliadau asid wrbenonig, gan gynnwys y deilliad urbenyloxy (UDA), sydd â gweithgaredd chwynladdol uchel heb effeithio'n negyddol ar dwf celloedd HeLa. Fe wnaethom hefyd ganfod bod deilliadau asid wrmotonig yn tarfu ar ficrotubules planhigion; yn ogystal, mae KAND yn effeithio ar ffilamentau actin ac yn achosi marwolaeth celloedd; Mae'r effeithiau amlochrog hyn yn wahanol i rai atalyddion microtubule hysbys ac yn awgrymu mecanwaith gweithredu newydd ar gyfer asid wrsonig, sy'n cynrychioli mantais bwysig wrth ddatblygu chwynladdwyr newydd.
Mae darganfod a chymhwyso cynhyrchion naturiol buddiol a'u deilliadau yn ffordd o wella ansawdd bywyd dynol. Mae metabolion eilaidd a gynhyrchir gan ficro-organebau, planhigion a phryfed wedi arwain at ddatblygiadau mawr mewn meddygaeth ac amaethyddiaeth. Mae llawer o wrthfiotigau a chyffuriau gwrth-lewcemia wedi'u datblygu o gynhyrchion naturiol. Yn ogystal, mae gwahanol fathau oplaladdwyr, mae ffwngladdiadau a chwynladdwyr yn cael eu tynnu o'r cynhyrchion naturiol hyn i'w defnyddio mewn amaethyddiaeth. Yn benodol, mae chwynladdwyr rheoli chwyn yn offer pwysig ar gyfer cynyddu cynnyrch cnydau mewn amaethyddiaeth fodern, ac mae gwahanol fathau o gyfansoddion eisoes yn cael eu defnyddio'n fasnachol. Ystyrir bod sawl proses cellog mewn planhigion, megis ffotosynthesis, metaboledd asidau amino, synthesis waliau celloedd, rheoleiddio mitosis, signalau ffytohormonau, neu synthesis protein, yn dargedau nodweddiadol chwynladdwyr. Mae cyfansoddion sy'n atal swyddogaeth microtubule yn ddosbarth cyffredin o chwynladdwyr sy'n effeithio ar dwf planhigion trwy effeithio ar reoleiddio mitotig2.
Mae microdiwbynnau yn gydrannau o'r cytoskeleton ac maent wedi'u cadw'n helaeth mewn celloedd ewcariotig. Mae'r heterodimer tiwbwlin yn cynnwys α-tiwbwlin a β-tiwbwlin sy'n ffurfio protoffilamentau microdiwbwn llinol, gyda 13 protoffilament yn ffurfio strwythur silindrog. Mae microdiwbynnau yn chwarae sawl rôl mewn celloedd planhigion, gan gynnwys pennu siâp celloedd, rhaniad celloedd, a chludiant mewngellol3,4. Mae celloedd planhigion yn cynnwys microdiwbynnau o dan y bilen plasma rhyngffas, a chredir bod y microdiwbynnau cortigol hyn, fel y'u gelwir, yn rheoli trefniadaeth microffibriliau cellwlos trwy reoleiddio cyfadeiladau synthase cellwlos4,5. Mae microdiwbynnau cortigol celloedd epidermaidd gwreiddiau, sy'n bresennol yn y parth o ymestyn cyflym blaen y gwreiddyn, wedi'u lleoli'n ochrol, ac mae microffibrau cellwlos yn dilyn y microdiwbynnau hyn ac yn cyfyngu ar gyfeiriad ehangu celloedd, a thrwy hynny'n hyrwyddo ymestyn celloedd anisotropig. Felly, mae swyddogaeth microdiwbwn yn gysylltiedig yn agos â morffoleg planhigion. Mae amnewidiadau asid amino mewn genynnau sy'n amgodio tiwbiwlin yn achosi ystum araeau microtubule cortigol a thwf ochr chwith neu dde yn Arabidopsis 6,7. Yn yr un modd, gall mwtaniadau mewn proteinau sy'n gysylltiedig â microtubule sy'n rheoleiddio dynameg microtubule hefyd arwain at dwf gwreiddiau ystumiedig8,9,10,11,12,13. Yn ogystal, mae triniaeth â chwynladdwyr sy'n tarfu ar ficrotubule fel disopyramid, a elwir hefyd yn pretilachlor, hefyd yn achosi twf gwreiddiau gogwydd ochr chwith14. Mae'r data hyn yn dangos bod rheoleiddio manwl gywir swyddogaeth microtubule yn hanfodol ar gyfer pennu cyfeiriad twf planhigion.
Mae gwahanol fathau o atalyddion microtubule wedi'u darganfod, ac mae'r cyffuriau hyn wedi gwneud cyfraniadau sylweddol at ymchwil cytosgerbydol, yn ogystal ag at amaethyddiaeth a meddygaeth2. Yn benodol, gall oryzalin, cyfansoddion dinitroanilin, disopyramid, cyfansoddion cysylltiedig â bensamid, a'u analogau atal swyddogaeth microtubule a thrwy hynny atal twf planhigion. Felly, fe'u defnyddir yn helaeth fel chwynladdwyr. Fodd bynnag, gan fod microtubules yn elfen bwysig o gelloedd planhigion ac anifeiliaid, mae'r rhan fwyaf o atalyddion microtubule yn cytotocsig i'r ddau fath o gell. Felly, er gwaethaf eu cyfleustodau cydnabyddedig fel chwynladdwyr, defnyddir nifer gyfyngedig o asiantau gwrth-ficrotubule at ddibenion ymarferol.
Mae Streptomyces yn genws o'r teulu Streptomyces, sy'n cynnwys bacteria aerobig, gram-bositif, ffilamentog ac mae'n adnabyddus am ei allu i gynhyrchu ystod eang o fetabolion eilaidd. Felly, fe'i hystyrir yn un o'r ffynonellau pwysicaf o gynhyrchion naturiol biolegol weithredol newydd. Yn yr astudiaeth gyfredol, fe wnaethom ddarganfod cyfansoddyn newydd o'r enw coumamonamid, a gafodd ei ynysu o Streptomyces werraensis MK493-CF1 a S. werraensis ISP 5486. Gan ddefnyddio dadansoddiad sbectrol a dadansoddiad sbectrol llawn, nodweddwyd strwythur coumamonamid a phenderfynwyd ar ei sgerbwd N-alcoxypyrrole unigryw. Canfuwyd bod asid ursmonig, canolradd synthetig o ursmonoamid a'i ddeilliadau, yn atal twf ac egino'r planhigyn model poblogaidd Arabidopsis thaliana. Mewn astudiaeth perthynas strwythur-gweithgaredd, fe wnaethom ganfod bod cyfansoddyn gyda C9 wedi'i addasu i asid ursonig, o'r enw deilliad nonyloxy o asid ursonig (KAND), yn gwella'r effaith ataliol ar dwf ac egino yn sylweddol. Yn arbennig, effeithiodd yr atalydd twf planhigion a ddarganfuwyd yn ddiweddar hefyd ar dwf tybaco a llysiau'r afu ac nid oedd yn gytotocsig i facteria na chelloedd HeLa. Ar ben hynny, mae rhai deilliadau asid wrmotonig yn achosi ffenoteip gwreiddyn ystumiedig, sy'n awgrymu bod y deilliadau hyn yn effeithio'n uniongyrchol neu'n anuniongyrchol ar ficrodiwbynnau. Yn gyson â'r syniad hwn, mae ein harsylwadau o ficrodiwbynnau wedi'u labelu naill ai'n imiwnohistochemegol neu â phroteinau fflwroleuol yn dangos bod triniaeth KAND yn dadbolymeru microdiwbynnau. Yn ogystal, mae triniaeth â deilliadau asid cwamamotonig yn tarfu ar ficroffilamentau actin. Felly, rydym wedi darganfod atalydd twf planhigion newydd y mae ei fecanwaith gweithredu unigryw yn cynnwys dinistrio'r cytoskeleton.
Ynysigwyd y straen MK493-CF1 o bridd yn Shinagawa-ku, Tokyo. Ffurfiodd y straen MK493-CF1 myceliwm stromal cangenog iawn. Penderfynwyd ar ddilyniant rhannol y genyn RNA ribosomal 16S (1422 bp). Mae'r straen hwn yn debyg iawn i S. werraensis (NBRC 13404T = ISP 5486, 1421/1422 bp, T: straen nodweddiadol, 99.93%). Yn seiliedig ar y canlyniad hwn, penderfynwyd bod y straen hwn yn perthyn yn agos i'r straen teip o S. werraensis. Felly, fe wnaethom enwi'r straen hwn dros dro yn S. werraensis MK493-CF1. Mae S. werraensis ISP 5486T hefyd yn cynhyrchu'r un cyfansoddion bioactif. Gan nad oedd llawer o ymchwil gynnar i gael cynhyrchion naturiol o'r micro-organeb hon, cynhaliwyd ymchwil gemegol bellach. Ar ôl tyfu S. werraensis MK493-CF1 ar gyfrwng haidd trwy eplesu cyflwr solid ar 30°C am 14 diwrnod, echdynnwyd y cyfrwng gyda 50% EtOH. Sychwyd 60 ml o sampl i gael 59.5 mg o echdyniad crai. Cafodd yr echdyniad crai ei roi dan HPLC cyfnod gwrthdro i roi N-methoxy-1H-pyrrole-2-carboxamid (1, o'r enw coumamonamid, 36.0 mg). Mae cyfanswm 1 tua 60% o'r echdyniad crai. Felly, penderfynon ni astudio priodweddau kumamotoamid 1 yn fanwl.
Mae coumamonamid 1 yn bowdr gwyn amorffaidd ac mae sbectrometreg màs cydraniad uchel (HRESIMS) yn cadarnhau C6H8N2O2 (Ffig. 1). Nodweddir y darn pyrrole wedi'i amnewid â C2 o'r cyfansoddyn hwn gan δH 6.94 (1H, t, J = 2.8, 4.8 Hz, H-4), δH 6.78 (1H, d, J = 2.5, δH yn y sbectrwm 1H NMR: 4.5 Hz, H-5) a δH 6.78 (1H, d, J = 2.5 Hz, H-6), ac mae'r sbectrwm 13C NMR yn dangos presenoldeb pedwar atom carbon sp2. Aseswyd presenoldeb grŵp amid yn y safle C2 trwy gydberthynas HMBC o'r proton C-3 i'r carbon carbonyl amid ar δC 161.1. Yn ogystal, mae pigau NMR 1H a 13C ar δH 4.10 (3H, S) ac δC 68.3 yn dangos presenoldeb grwpiau N-methoxy yn y moleciwl. Er nad oedd safle cywir y grŵp methoxy wedi'i bennu eto gan ddefnyddio dadansoddiad sbectrosgopig megis sbectrosgopeg gwahaniaeth uwch a thalfyriad Overhauser niwclear (NOEDF), daeth N-methoxy-1H-pyrrole-2-carboxamid yn gyfansoddyn ymgeisydd cyntaf.
I bennu strwythur cywir 1, perfformiwyd synthesis cyflawn (Ffig. 2a). Arweiniodd triniaeth 2-aminopyridin 2 sydd ar gael yn fasnachol gydag m-CPBA at yr N-ocsid 3 cyfatebol mewn cynnyrch meintiol. Ar ôl 2-aminoasidiad 2, cynhaliwyd yr adwaith cyclocondensation a ddisgrifiwyd gan Abramovich mewn bensen ar 90°C i gael yr 1-hydroxy-1H-pyrrole-2-carbonitrile 5 a ddymunir mewn gramau. Cyflymder 60% (dau gam). 15,16. Yna rhoddodd methyliad a hydrolysis 4 asid 1-methoxy-1H-pyrrole-2-carboxylig (a elwir yn "asid cumotonig", 6) mewn cynnyrch da (70%, dau gam). Yn olaf, rhoddodd amidiad trwy ganolradd clorid asid 6 gan ddefnyddio amonia dyfrllyd Kumamoto amid 1 mewn cynnyrch o 98%. Roedd holl ddata sbectrol yr 1 a syntheseiddiwyd yn debyg i'r 1 a ynyswyd, felly penderfynwyd strwythur 1;
Synthesis cyffredinol a dadansoddiad o weithgaredd biolegol wrbenamid ac asid wrbenig. (a) Synthesis cyflawn o amid Kumamoto. (b) Tyfwyd eginblanhigion Arabidopsis Columbia (Col) math gwyllt saith diwrnod oed ar blatiau Murashige a Skoog (MS) yn cynnwys coumamonamid 6 neu coumamonamid 1 yn y crynodiadau a nodwyd. Bar graddfa = 1 cm.
Yn gyntaf, fe wnaethom asesu gweithgareddau biolegol urbenamid a'i ganolraddau am eu gallu i fodiwleiddio twf planhigion. Fe wnaethom ychwanegu gwahanol grynodiadau o ursmonamid 1 neu asid ursmonig 6 at gyfrwng agar MS a meithrin eginblanhigion Arabidopsis thaliana ar y cyfrwng hwn. Dangosodd yr assays hyn fod crynodiadau uchel (500 μM) o 6 yn atal twf gwreiddiau (Ffig. 2b). Nesaf, fe wnaethom gynhyrchu gwahanol ddeilliadau trwy amnewid safle N1 6 a chynnal astudiaethau perthynas strwythur-gweithgaredd arnynt (disgrifir y broses synthesis analog yn y Wybodaeth Atodol (SI)). Tyfwyd eginblanhigion Arabidopsis ar gyfrwng yn cynnwys 50 μM o ddeilliadau asid ursonig, a mesurwyd hyd y gwreiddyn. fel y dangosir yn y llun. Fel y dangosir yn Ffigurau 3a, b, ac S1, mae gan asidau coumamo wahanol hydau o gadwyni alcocsi llinol (9, 10, 11, 12, a 13) neu gadwyni alcocsi mawr (15, 16, a 17) yn y safle N1. Dangosodd y deilliadau ataliad sylweddol o dwf gwreiddiau. Yn ogystal, gwelsom fod rhoi 200 μM o 10, 11, neu 17 yn atal egino (Ffigau 3c ac S2).
Astudiaeth o'r berthynas strwythur-gweithgaredd rhwng Kumamoto amid a chyfansoddion cysylltiedig. (a) Cynllun strwythur a synthesis analogau. (b) Mesur hyd gwreiddiau eginblanhigion 7 diwrnod oed a dyfwyd ar gyfrwng MS gyda neu heb ddeilliadau coumamonamid 50 μM. Mae sêr yn dynodi gwahaniaethau sylweddol gyda thriniaeth ffug (prawf t, p< 0.05). n>18. Dangosir data fel cymedr ± SD. Mae nt yn golygu “heb ei brofi” oherwydd ni wnaeth mwy na 50% o'r hadau egino. (c) Mesur cyfradd egino hadau wedi'u trin a gafodd eu deori am 7 diwrnod mewn cyfrwng MS gyda neu heb 200 μM coumamonamid a chyfansoddion cysylltiedig. Mae seren yn dynodi gwahaniaethau sylweddol gyda thriniaeth ffug (prawf chi-sgwâr). n=96.
Yn ddiddorol, gostyngodd ychwanegu cadwyni ochr alcyl sy'n hirach na C9 y gweithgaredd ataliol, gan awgrymu bod angen cadwyni ochr o faint penodol ar gyfansoddion sy'n gysylltiedig ag asid kumamotoic i arddangos eu gweithgaredd biolegol.
Gan fod dadansoddiad perthynas strwythur-gweithgaredd wedi dangos bod C9 wedi'i addasu i asid wrsonig a bod y deilliad nonyloxy o asid wrsonig (y cyfeirir ato o hyn ymlaen fel KAND 11) yn atalydd twf planhigion mwyaf effeithiol, fe wnaethom gynnal nodweddiad mwy manwl o KAND 11. Roedd trin Arabidopsis â 50 μM o KAND 11 bron yn atal egino'n llwyr, tra bod crynodiadau is (40, 30, 20, neu 10 μM) o KAND 11 yn atal twf gwreiddiau mewn modd sy'n ddibynnol ar ddos (Ffig. 4a, b). I brofi a yw KAND 11 yn effeithio ar hyfywedd meristem gwreiddiau, fe wnaethom archwilio meristemau gwreiddiau wedi'u staenio â propidium ïodid (PI) a mesur maint arwynebedd y meristem. Roedd maint meristem yr eginblanhigion a dyfwyd ar gyfrwng yn cynnwys 25 μM o KAND-11 yn 151.1 ± 32.5 μm, tra bod maint meristem yr eginblanhigion a dyfwyd ar gyfrwng rheoli yn cynnwys DMSO yn 264.7 ± 30.8 μm (Ffig. 4c, d), sy'n dangos bod KAND-11 yn adfer gweithgaredd cellog. Meristem gwreiddiau. Yn gyson â hyn, gostyngodd triniaeth KAND 11 faint o signal y marcwr rhannu celloedd CDKB2;1p::CDKB2;1-GUS ym meristem y gwreiddyn (Ffig. 4e) 17 . Mae'r canlyniadau hyn yn dangos bod KAND 11 yn atal twf gwreiddiau trwy leihau gweithgaredd amlhau celloedd.
Dadansoddiad o effaith ataliol deilliadau asid wrbenonig (deilliadau urbenyloxy) ar dwf. (a) Eginblanhigion Col math gwyllt 7 diwrnod oed a dyfwyd ar blatiau MS gyda'r crynodiadau a nodwyd o KAND 11. Bar graddfa = 1 cm. (b) Mesur hyd y gwreiddyn. Mae llythrennau'n dynodi gwahaniaethau arwyddocaol (prawf HSD Tukey, p< 0.05). n>16. Dangosir data fel cymedr ± SD. (c) Microsgopeg gonfocal o wreiddiau Col math gwyllt wedi'u lliwio â propidiwm ïodid a dyfwyd ar blatiau MS gyda neu heb 25 μM KAND 11. Mae cromfachau gwyn yn dynodi meristem gwreiddyn. Bar graddfa = 100 µm. (d) Mesur maint meristem gwreiddyn (n = 10 i 11). Penderfynwyd ar wahaniaethau ystadegol gan ddefnyddio prawf-t (p< 0.05). Mae'r bariau'n cynrychioli maint cyfartalog y meristem. (e) Microsgopeg cyferbyniad ymyrraeth wahaniaethol (DIC) o feristem gwreiddyn sy'n cynnwys yr adeiledd CDKB2; 1pro: CDKB2; 1-GUS wedi'i staenio a'i staenio ar eginblanhigion 5 diwrnod oed a dyfwyd ar blatiau MS gyda neu heb assay KAND 25 µM.
Profwyd ffytowenwyndra KAND 11 ymhellach gan ddefnyddio planhigyn deugotyledonaidd arall, tybaco (Nicotiana tabacum), ac organeb model planhigion tir pwysig, llysiau'r afu (Marchantia polymorpha). Fel yn achos Arabidopsis, cynhyrchodd eginblanhigion tybaco SR-1 a dyfwyd ar gyfrwng yn cynnwys 25 μM o KAND 11 wreiddiau byrrach (Ffig. 5a). Yn ogystal, eginodd 40 o 48 o hadau ar blatiau yn cynnwys 200 μM o KAND 11, tra bod pob un o'r 48 o hadau wedi egino ar gyfryngau wedi'u trin â ffug, gan ddangos bod crynodiadau uwch o KAND yn arwyddocaol (p< 0.05; prawf chi -sgwâr) yn atal egino tybaco. (Ffig. 5b). Yn ogystal, roedd crynodiad KAND 11 a ataliodd dwf bacteria mewn llysiau'r afu yn debyg i'r crynodiad effeithiol yn Arabidopsis (Ffig. 5c). Mae'r canlyniadau hyn yn dangos y gall KAND 11 atal twf amrywiaeth o blanhigion. Yna, fe wnaethom ymchwilio i'r cytotocsinedd posibl o gyfansoddion sy'n gysylltiedig â monoamid arth mewn organebau eraill, sef celloedd HeLa dynol a straen Escherichia coli DH5α, fel cynrychiolwyr celloedd anifeiliaid a bacteriol uwch, yn y drefn honno. Mewn cyfres o asesiadau amlhau celloedd, gwelsom nad oedd coumamonamid 1, asid coumamonamidig 6, a KAND 11 yn effeithio ar dwf celloedd HeLa na E. coli ar grynodiadau o 100 μM (Ffig. 5d,e).
Atal twf KAND 11 mewn organebau nad ydynt yn Arabidopsis. (a) Tyfwyd eginblanhigion tybaco SR-1 math gwyllt pythefnos oed ar blatiau MS wedi'u lleoli'n fertigol yn cynnwys 25 μM KAND 11. (b) Tyfwyd eginblanhigion tybaco SR-1 math gwyllt pythefnos oed ar blatiau MS wedi'u lleoli'n llorweddol yn cynnwys 200 μM KAND 11. (c) Blagur llysiau'r afu Tak-1 math gwyllt pythefnos oed a dyfwyd ar blatiau Gamborg B5 gyda'r crynodiadau a nodwyd o KAND 11. Mae saethau coch yn dynodi sborau a stopiodd dyfu o fewn y cyfnod magu pythefnos. (d) Asesiad amlhau celloedd celloedd HeLa. Mesurwyd nifer y celloedd hyfyw ar gyfnodau amser penodol gan ddefnyddio pecyn cyfrif celloedd 8 (Dojindo). Fel rheolydd, triniwyd celloedd HeLa â 5 μg/ml actinomycin D (Act D), sy'n atal trawsgrifio polymeras RNA ac yn achosi marwolaeth celloedd. Perfformiwyd dadansoddiadau mewn tair copi. (e) Asesiad amlhau celloedd E. coli. Dadansoddwyd twf E. coli trwy fesur OD600. Fel rheolydd, cafodd celloedd eu trin â 50 μg/ml o ampicillin (Amp), sy'n atal synthesis waliau celloedd bacteriol. Perfformiwyd dadansoddiadau mewn tair copi.
I ddatgodio mecanwaith gweithredu cytotocsinedd a achosir gan gyfansoddion sy'n gysylltiedig ag wramid, fe wnaethom ail-ddadansoddi deilliadau asid wrbenig ag effeithiau ataliol cymedrol, fel y dangosir yn y llun. Fel y dangosir yn Ffigurau 2b, 6a, cynhyrchodd eginblanhigion a dyfwyd ar blatiau agar yn cynnwys crynodiadau uchel (200 μM) o asid wrmotonig 6 wreiddiau byrrach a chrwm i'r chwith (θ = – 23.7 ± 6.1), tra o eginblanhigion a dyfwyd ar y cyfrwng rheoli, cynhyrchodd yr eginblanhigion wreiddiau bron yn syth (θ = – 3.8 ± 7.1). Gwyddys bod y twf gogwydd nodweddiadol hwn yn deillio o gamweithrediad microdiwbynnau cortigol14,18. Yn gyson â'r canfyddiad hwn, fe wnaeth y cyffuriau ansefydlogi microdiwbynnau disopyramid ac oryzalin achosi gogwydd gwreiddiau tebyg o dan ein hamodau twf (Ffigau 2b, 6a). Ar yr un pryd, fe wnaethom brofi deilliadau asid wrmotonig a dewis nifer ohonynt a, mewn crynodiadau penodol, a achosodd dwf gwreiddiau gogwydd. Newidiodd cyfansoddion 8, 9, a 15 gyfeiriad twf gwreiddiau ar 75 μM, 50 μM, a 40 μM, yn y drefn honno, gan ddangos y gall y cyfansoddion hyn ddadsefydlogi microdiwbynnau yn effeithiol (Ffig. 2b, 6a). Profon ni hefyd y deilliad asid ursolig mwyaf grymus, KAND 11, ar grynodiad is (15 µM) a chanfod bod rhoi KAND 11 yn atal twf gwreiddiau a bod cyfeiriad twf gwreiddiau yn anwastad, er eu bod yn tueddu i ogwyddo i'r chwith (Ffigur C3). Gan fod crynodiadau uwch o gyffuriau sy'n dadsefydlogi microdiwbynnau weithiau'n atal twf planhigion yn hytrach nag achosi gogwydd gwreiddiau, fe wnaethon ni asesu'r posibilrwydd bod KAND 11 yn effeithio ar ficrodiwbynnau trwy arsylwi microdiwbynnau cortigol mewn celloedd epidermaidd gwreiddiau. Dangosodd imiwnohistochemeg gan ddefnyddio gwrthgyrff gwrth-β-tiwbwlin mewn celloedd epidermaidd gwreiddiau eginblanhigion a gafodd eu trin â 25 μM o KAND 11 ddiflaniad bron pob microdiwbwn cortigol mewn celloedd epidermaidd yn y parth ymestyn (Ffig. 6b). Mae'r canlyniadau hyn yn dangos bod asid cwamotonig a'i ddeilliadau'n gweithredu'n uniongyrchol neu'n anuniongyrchol ar ficrotubulau i'w tarfu a bod y cyfansoddion hyn yn atalyddion microtubulau newydd.
Mae asid wrsonig a'i ddeilliadau yn newid microdiwbynnau cortigol yn Arabidopsis thaliana. (a) Ongl gogwydd y gwreiddyn wedi'i fesur ym mhresenoldeb amrywiol ddeilliadau asid wrmotonig yn y crynodiadau a nodwyd. Dadansoddwyd hefyd effeithiau dau gyfansoddyn y gwyddys eu bod yn atal microdiwbynnau: disopyramid ac oryzalin. Mae'r mewnosodiad yn dangos y safon a ddefnyddir i fesur ongl twf gwreiddyn. Mae sêr yn dynodi gwahaniaethau sylweddol gyda thriniaeth ffug (prawf t, p< 0.05). n>19. Bar graddfa = 1 cm. (b) Microdiwbynnau cortigol mewn celloedd epidermaidd yn y parth ymestyn. Cafodd microdiwbynnau mewn gwreiddiau Arabidopsis Col math gwyllt a dyfwyd ar blatiau MS gyda neu heb 25 μM KAND 11 eu delweddu trwy staenio imiwnohistochemegol gan ddefnyddio gwrthgyrff cynradd β-tiwbiwlin ac gwrthgyrff eilaidd cysylltiedig ag Alexa Fluor. Bar graddfa = 10 µm. (c) Strwythur mitotig microdiwbynnau ym meristem y gwreiddyn. Cafodd microdiwbynnau eu delweddu gan ddefnyddio staenio imiwnohistochemegol. Cyfrifwyd strwythurau mitotig, gan gynnwys parthau proffas, gwerthydau, a phragmoplastau, o ddelweddau confocal. Mae saethau'n dynodi strwythurau microdiwbynnau mitotig. Mae serennod yn dynodi gwahaniaethau sylweddol gyda thriniaeth ffug (prawf t, p< 0.05). n>9. Bar graddfa = 50 µm.
Er bod gan Ursa y gallu i amharu ar swyddogaeth microdiwbynnau, disgwylir i'w fecanwaith gweithredu fod yn wahanol i asiantau dadbolymeru microdiwbynnau nodweddiadol. Er enghraifft, mae crynodiadau uwch o asiantau dadbolymeru microdiwbynnau fel disopyramid ac oryzalin yn achosi ehangu anisotropig celloedd epidermaidd, tra nad yw KAND 11 yn gwneud hynny. Yn ogystal, arweiniodd cyd-gymhwyso KAND 11 a disopyramid at ymateb twf gwreiddiau cyfun a achosir gan disopyramid a gwelwyd ataliad twf a achosir gan KAND 11 (Ffig. S4). Dadansoddwyd hefyd ymateb y mutant disopyramid 1-1 gorsensitif (phs1-1) i KAND 11. Mae gan phs1-1 dreiglad pwynt cinas tiwbwlin anghanonig ac mae'n cynhyrchu gwreiddiau byrrach pan gaiff ei drin â disopyramid9,20. Roedd gan eginblanhigion mutant phs1-1 a dyfwyd ar gyfrwng agar yn cynnwys KAND 11 wreiddiau byrrach tebyg i'r rhai a dyfwyd ar disopyramid (ffig. S5).
Yn ogystal, gwelsom strwythurau microdiwbynnau mitotig, megis parthau proffas, gwerthydau, a phragmoplastau, ym meristem gwreiddyn eginblanhigion a gafodd eu trin â KAND 11. Yn gyson â'r arsylwadau ar gyfer CDKB2;1p::CDKB2;1-GUS, gwelwyd gostyngiad sylweddol yn nifer y microdiwbynnau mitotig (Ffig. .6c).
I nodweddu cytotocsinedd KAND 11 ar benderfyniad isgellog, fe wnaethom drin celloedd ataliad tybaco BY-2 gyda KAND 11 ac arsylwi eu hymateb. Yn gyntaf, fe wnaethom ychwanegu KAND 11 at gelloedd BY-2 sy'n mynegi TagRFP-TUA6, sy'n labelu microdiwbynnau'n fflwroleuol, i asesu effaith KAND 11 ar ficrodiwbynnau cortigol. Aseswyd dwysedd microdiwbynnau cortigol gan ddefnyddio dadansoddiad delweddau, a fesurodd ganran y picseli cytosgerbydol ymhlith picseli cytoplasmig. Dangosodd canlyniadau'r assay, ar ôl triniaeth gyda 50 μM neu 100 μM o KAND 11 am 1 awr, fod y dwysedd wedi gostwng yn sylweddol i 0.94 ± 0.74% neu 0.23 ± 0.28%, yn y drefn honno, tra bod dwysedd y celloedd a gafodd eu trin â DMSO yn cyfateb i 1.61 ± 0.34% (Ffig. 7a). Mae'r canlyniadau hyn yn gyson â'r arsylwad yn Arabidopsis bod triniaeth KAND 11 yn achosi dadbolymeriad microdiwbynnau cortigol (Ffig. 6b). Fe wnaethom hefyd archwilio'r llinell BY-2 gyda ffilamentau actin wedi'u labelu â GFP-ABD ar ôl triniaeth gyda'r un crynodiad o KAND 11 a gweld bod triniaeth KAND 11 wedi tarfu ar y ffilamentau actin. Gostyngodd triniaeth gyda 50 μM neu 100 μM o KAND 11 am 1 awr ddwysedd ffilament actin yn sylweddol i 1.20 ± 0.62% neu 0.61 ± 0.26%, yn y drefn honno, tra bod y dwysedd mewn celloedd a gafodd eu trin â DMSO yn 1.69 ± 0.51% (Ffig. 2). 7b). Mae'r canlyniadau hyn yn cyferbynnu ag effeithiau propyzamid, nad yw'n effeithio ar ffilamentau actin, a latrunculin B, dadbolymerydd actin nad yw'n effeithio ar ficrodiwbynnau (Ffigur SI S6). Yn ogystal, ni effeithiodd triniaeth gyda coumamonamid 1, asid coumamonamid 6, neu KAND 11 ar ficrodiwbynnau mewn celloedd HeLa (Ffigur SI S7). Felly, credir bod mecanwaith gweithredu KAND 11 yn wahanol i fecanwaith gweithredu tarfwyr cytosgerbwd hysbys. Yn ogystal, datgelodd ein harsylwad microsgopig o gelloedd BY-2 a gafodd eu trin â KAND 11 ddechrau marwolaeth celloedd yn ystod triniaeth KAND 11 a dangosodd nad oedd cyfran y celloedd marw wedi'u lliwio'n las Evans wedi cynyddu'n sylweddol ar ôl 30 munud o driniaeth KAND 11, ond ar ôl 90 munud o driniaeth gyda 50 μM neu 100 μM KAND, cynyddodd nifer y celloedd marw i 43.7% neu 80.1%, yn y drefn honno (Ffig. 7c). Gyda'i gilydd, mae'r data hyn yn dangos bod y deilliad asid wrsolig newydd KAND 11 yn atalydd cytosgerbwd penodol i blanhigion gyda mecanwaith gweithredu anhysbys o'r blaen.
Mae KAND yn effeithio ar ficrotubules cortigol, ffilamentau actin, a hyfywedd celloedd tybaco BY-2. (a) Delweddu microtubules cortigol mewn celloedd BY-2 ym mhresenoldeb TagRFP-TUA6. Archwiliwyd celloedd BY-2 a gafodd eu trin â KAND 11 (50 μM neu 100 μM) neu DMSO gan ddefnyddio microsgopeg gonffocal. Cyfrifwyd dwysedd microtubules cortigol o ficrograffau o 25 o gelloedd annibynnol. Mae llythrennau'n dynodi gwahaniaethau arwyddocaol (prawf HSD Tukey, t< 0.05). Bar graddfa = 10 µm. (b) Ffilamentau actin cortigol mewn celloedd BY-2 wedi'u delweddu ym mhresenoldeb GFP-ABD2. Archwiliwyd celloedd BY-2 a gafodd eu trin â KAND 11 (50 μM neu 100 μM) neu DMSO gan ddefnyddio microsgopeg gonffocal. Cyfrifwyd dwysedd ffilamentau actin cortigol o ficrograffau o 25 o gelloedd annibynnol. Mae llythrennau'n dynodi gwahaniaethau arwyddocaol (prawf HSD Tukey, p< 0.05). Bar graddfa = 10 µm. (c) Arsylwi celloedd BY-2 marw trwy staenio glas Evans. Archwiliwyd celloedd BY-2 a gafodd eu trin â KAND 11 (50 μM neu 100 μM) neu DMSO trwy ficrosgopeg maes llachar. n=3. Bar graddfa = 100 µm.
Mae darganfod a chymhwyso cynhyrchion naturiol newydd wedi arwain at ddatblygiadau sylweddol mewn gwahanol agweddau ar fywyd dynol, gan gynnwys meddygaeth ac amaethyddiaeth. Mae ymchwil hanesyddol wedi'i chynnal i gael cyfansoddion defnyddiol o adnoddau naturiol. Yn benodol, gwyddys bod actinomycetes yn ddefnyddiol fel gwrthfiotigau gwrthbarasitig ar gyfer nematodau oherwydd eu gallu i gynhyrchu amrywiol fetabolion eilaidd fel avermectin, prif gyfansoddyn ivermectin a bleomycin a'i ddeilliadau, a ddefnyddir yn feddyginiaethol fel asiant gwrthganser21,22. Yn yr un modd, mae amrywiaeth o gyfansoddion chwynladdol wedi'u darganfod o actinomycetes, ac mae rhai ohonynt eisoes yn cael eu defnyddio'n fasnachol1,23. Felly, ystyrir bod dadansoddi metabolion actinomycete i ynysu cynhyrchion naturiol gyda gweithgareddau biolegol dymunol yn strategaeth effeithiol. Yn yr astudiaeth hon, fe wnaethom ddarganfod cyfansoddyn newydd, coumamonamid, o S. werraensis a'i syntheseiddio'n llwyddiannus. Mae asid wrsonig yn ganolradd synthetig o urbenamid a'i ddeilliadau. Gall achosi cyrlio gwreiddiau nodweddiadol, arddangos gweithgaredd chwynladdol cymedrol i gryf, a niweidio microdiwbynnau planhigion yn uniongyrchol neu'n anuniongyrchol. Fodd bynnag, gall mecanwaith gweithredu asid wrmotonig fod yn wahanol i fecanwaith gweithredu atalyddion microtubule presennol, gan fod KAND 11 hefyd yn tarfu ar ffilamentau actin ac yn achosi marwolaeth celloedd, gan awgrymu mecanwaith rheoleiddio lle mae asid wrmotonig a'i ddeilliadau'n dylanwadu ar ystod eang o strwythurau cytosgerbydol.
Bydd nodweddu asid wrbenonig ymhellach yn fanylach yn helpu i ddeall mecanwaith gweithredu asid wrbenonig yn well. Yn benodol, y nod nesaf yw gwerthuso gallu asid wrsonig i rwymo i ficrodiwbynnau lleihaol i benderfynu a yw asid wrsonig a'i ddeilliadau yn gweithredu'n uniongyrchol ar ficrodiwbynnau ac yn eu dadbolymeru, neu a yw eu gweithred yn arwain at ansefydlogi microdiwbynnau. Yn ogystal, yn yr achos lle nad yw microdiwbynnau yn darged uniongyrchol, bydd nodi safle gweithredu a thargedau moleciwlaidd asid wrsonig ar gelloedd planhigion yn helpu i ddeall priodweddau cyfansoddion cysylltiedig a ffyrdd posibl o wella gweithgaredd chwynladdol ymhellach. Datgelodd ein hasesiad bioactifedd allu cytotocsig unigryw asid wrsonig ar dwf planhigion fel Arabidopsis thaliana, tybaco a llysiau'r afu, tra na chafodd celloedd E. coli na HeLa eu heffeithio. Mae ychydig neu ddim gwenwyndra i gelloedd anifeiliaid yn fantais i ddeilliadau asid wrsonig os cânt eu datblygu fel chwynladdwyr i'w defnyddio mewn caeau amaethyddol agored. Yn wir, gan fod microdiwbynnau yn strwythurau cyffredin mewn ewcariotau, mae eu hataliad dethol mewn planhigion yn ofyniad allweddol ar gyfer chwynladdwyr. Er enghraifft, defnyddir propyzamid, asiant dadbolymeru microdiwbynnau sy'n rhwymo'n uniongyrchol i diwbwlin ac yn atal polymeriad, fel chwynladdwr oherwydd ei wenwyndra isel i gelloedd anifeiliaid24. Mewn cyferbyniad â disopyramid, mae gan bensamidau cysylltiedig wahanol benodolrwydd targed. Yn ogystal â microdiwbynnau planhigion, mae RH-4032 neu bensoxamid hefyd yn atal microdiwbynnau celloedd anifeiliaid neu oomycetes, yn y drefn honno, a defnyddir zalilamid fel ffwngladdwr oherwydd ei ffytowenwyndra isel25,26,27. Mae'r arth a ddarganfuwyd yn ddiweddar a'i ddeilliadau yn arddangos cytowenwyndra dethol yn erbyn planhigion, ond mae'n werth nodi y gallai addasiadau pellach newid eu penodolrwydd targed, gan ddarparu deilliadau ychwanegol o bosibl ar gyfer rheoli ffwng pathogenig neu oomycetes.
Mae priodweddau unigryw asid wrbenonig a'i ddeilliadau yn ddefnyddiol ar gyfer eu datblygiad fel chwynladdwyr a'u defnyddio fel offer ymchwil. Mae pwysigrwydd y cytoskeleton wrth reoli siâp celloedd planhigion yn cael ei gydnabod yn eang. Mae astudiaethau cynharach wedi dangos bod planhigion wedi esblygu mecanweithiau cymhleth o drefniadaeth microtiwbynnau cortigol trwy reoli dynameg microtiwbynnau i reoli morffogenesis yn iawn. Mae nifer fawr o foleciwlau sy'n gyfrifol am reoleiddio gweithgaredd microtiwbynnau wedi'u nodi, ac mae ymchwil gysylltiedig yn dal i fynd rhagddi3,4,28. Nid yw ein dealltwriaeth gyfredol o ddeinameg microtiwbynnau mewn celloedd planhigion yn egluro mecanweithiau trefniadaeth microtiwbynnau cortigol yn llawn. Er enghraifft, er y gall disopyramid ac oryzalin ddadbolymeru microtiwbynnau, mae disopyramid yn achosi ystumio gwreiddiau difrifol tra bod gan oryzalin effaith gymharol ysgafn. Ar ben hynny, mae mwtaniadau mewn tiwbwlin, sy'n sefydlogi microtiwbynnau, hefyd yn achosi dextrorotation mewn gwreiddiau, tra nad yw paclitaxel, sydd hefyd yn sefydlogi dynameg microtiwbynnau, yn gwneud hynny. Felly, dylai astudio ac adnabod targedau moleciwlaidd asid wrsolig ddarparu mewnwelediadau newydd i reoleiddio microtiwbynnau cortigol planhigion. Yn yr un modd, bydd cymariaethau yn y dyfodol rhwng cemegau sy'n effeithiol wrth hyrwyddo twf ystumiedig, fel disopyramid, a chemegau llai effeithiol, fel oryzalin neu asid kumamotorig, yn rhoi cliwiau i sut mae twf ystumiedig yn digwydd.
Ar y llaw arall, mae aildrefniadau cytosgerbydol sy'n gysylltiedig ag amddiffyn yn bosibilrwydd arall i esbonio cytotocsinedd asid wrsonig. Weithiau mae heintio pathogen neu gyflwyno elicitor i gelloedd planhigion yn achosi dinistrio'r cytosgerbwd a marwolaeth celloedd wedi hynny29. Er enghraifft, adroddwyd bod cryptoxanthin sy'n deillio o oomycete yn tarfu ar ficrotubules a ffilamentau actin cyn marwolaeth celloedd tybaco, yn debyg i'r hyn sy'n digwydd gyda thriniaeth KAND30,31. Arweiniodd y tebygrwydd rhwng ymatebion amddiffyn ac ymatebion cellog a achosir gan asid wrsonig ni i ddamcaniaethu eu bod yn sbarduno prosesau cellog cyffredin, er bod effaith gyflymach a chryfach asid wrsonig na cryptoxanthin yn amlwg. Fodd bynnag, mae astudiaethau wedi dangos bod tarfu ar ffilamentau actin yn hyrwyddo marwolaeth celloedd digymell, nad yw bob amser yn cyd-fynd ag amhariad ar ficrotubules29. Yn ogystal, mae'n parhau i fod i'w weld a yw'r pathogen neu'r elicitor yn achosi twf gwreiddiau ystumiedig, fel mae deilliadau asid wrsonig yn ei wneud. Felly, mae gwybodaeth foleciwlaidd sy'n cysylltu ymatebion amddiffyn a'r cytosgerbwd yn broblem ddeniadol i'w datrys. Drwy fanteisio ar bresenoldeb cyfansoddion pwysau moleciwlaidd isel sy'n gysylltiedig ag asid wrsonig, yn ogystal ag ystod o ddeilliadau â gwahanol gryfderau, gallant ddarparu cyfleoedd i dargedu mecanweithiau cellog anhysbys.
Gyda'i gilydd, bydd darganfod a chymhwyso cyfansoddion newydd sy'n modiwleiddio dynameg microdiwbynnau yn darparu dulliau pwerus i fynd i'r afael â'r mecanweithiau moleciwlaidd cymhleth sy'n sail i bennu siâp celloedd planhigion. Yn y cyd-destun hwn, gall y cyfansoddyn asid wrmotonig a ddatblygwyd yn ddiweddar, sy'n effeithio ar ficrodiwbynnau a ffilamentau actin ac yn achosi marwolaeth celloedd, roi cyfle i ddatgodio'r cysylltiad rhwng rheoli microdiwbynnau a'r mecanweithiau eraill hyn. Felly, bydd dadansoddiad cemegol a biolegol gan ddefnyddio asid wrbenonig yn ein helpu i ddeall y mecanweithiau rheoleiddio moleciwlaidd sy'n rheoli cytoskeleton y planhigyn.
Brechwch S. werraensis MK493-CF1 i mewn i fflasg Erlenmeyer 500 mL â baffl sy'n cynnwys 110 mL o gyfrwng hadau sy'n cynnwys 2% (w/v) galactos, 2% (w/v) past hanfod, 1% (w/v) cyfansoddiad Bacto. N-soyton (Thermo Fisher Scientific, Inc.), 0.5% (w/v) dyfyniad corn (KOGOSTCH Co., Ltd., Japan), 0.2% (w/v) (NH4)2SO4 a 0.2% CaCO3 mewn dŵr wedi'i ddad-ïoneiddio. (pH 7.4 cyn sterileiddio). Cafodd y diwylliannau hadau eu magu ar ysgwydwr cylchdro (180 rpm) ar 27°C am 2 ddiwrnod. Tyfu cynhyrchiad trwy eplesu cyflwr solid. Trosglwyddwyd y diwylliant hadau (7 ml) i fflasg K-1 500 ml yn cynnwys 40 g o gyfrwng cynhyrchu yn cynnwys 15 g o haidd wedi'i wasgu (MUSO Co., Ltd., Japan) a 25 g o ddŵr wedi'i ddad-ïoneiddio (pH heb ei addasu cyn sterileiddio). Cynhaliwyd eplesiad ar 30°C yn y tywyllwch am 14 diwrnod. Echdynnwyd y deunydd eplesu gyda 40 ml/potel o EtOH a'i allgyrchu (1500 g, 4°C, 10 munud). Echdynnwyd uwchnofiant y diwylliant (60 ml) gyda chymysgedd o 10% MeOH/EtOAc. Anweddwyd yr haen organig o dan bwysau llai i gael gweddillion (59.5 mg), a gafodd ei brofi trwy HPLC gydag eliwiad graddiant (0–10 munud: 90%) ar golofn cyfnod gwrthdro (SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG120, 5 μm, ID 10 mm × hyd 250 mm) H2O/CH3CN, 10–35 munud: 90% H2O/CH3CN i 70% H2O/CH3CN (graddiant), 35–45 munud: 90% H2O/EtOH, 45–155 munud: 90% H2O/EtOH i 100% EtOH (graddiant (graddiant), 155–200 munud: 100% EtOH) ar gyfradd llif o 1.5 ml/munud, ynyswyd coumamonamid (1, 36.0 mg) fel powdr gwyn amorffaidd.
Cwmamotoamid(1); 1H-NMR (500 MHz, CDCl3) δ 6.93 (t, J = 2.5 Hz, 1H), 6.76 (dd, J = 4.3, 1.8 Hz, 1H), 6.05 (t, J = 3.8 Hz, 1H). ), 4.08 (s, 3H); 13C-NMR (125 MHz, CDCl3) δ 161.1, 121.0, 119.9, 112.2, 105.0, 68.3; ESI-HRMS [M+H]+: [C6H9N2O2]+ gwerth cyfrifedig: 141.0659, gwerth mesuredig: 141.0663, IR νmax 3451, 3414, 3173, 2938, 1603, 1593, 1537 cm–1.
Cafwyd hadau Columbia (Col-0) o Ganolfan Adnoddau Biolegol Arabidopsis (ABRC) gyda chaniatâd i'w defnyddio at ddibenion ymchwil. Cafodd hadau Col-0 eu lluosogi a'u cynnal o dan amodau ein labordy a'u defnyddio fel planhigion Arabidopsis gwyllt. Cafodd hadau Arabidopsis eu sterileiddio ar yr wyneb a'u meithrin mewn cyfrwng Murashige a Skoog hanner cryfder yn cynnwys 2% swcros (Fujifilm Wako Pure Chemical), 0.05% (w/v) asid 2-(4-morpholino)ethanesulfonig (MES) (Fujifilm Wako Pure Chemical).) ac 1.5% agar (Fujifilm Wako Pure Chemical), pH 5.7, ar 23 °C a golau cyson. Darparwyd hadau'r mutant phs1-1 gan T. Hashimoto (Sefydliad Gwyddoniaeth a Thechnoleg Nara).
Darparwyd hadau o straen SR-1 gan T. Hashimoto (Sefydliad Gwyddoniaeth a Thechnoleg Nara) a'u defnyddio fel planhigion tybaco gwyllt. Cafodd hadau tybaco eu sterileiddio ar yr wyneb a'u socian mewn dŵr di-haint am dair noson i hyrwyddo egino, yna eu rhoi mewn toddiant hanner cryfder yn cynnwys 2% swcros, 0.05% (w/v) MES, a 0.8% gwm gellan (Fujifilm Wako Pure Chemical) Murashige. a chyfrwng Skoog) gyda pH 5.7 a'u magu ar 23°C o dan olau cyson.
Darparwyd y straen Tak-1 gan T. Kohchi (Prifysgol Kyoto) a chafodd ei ddefnyddio fel yr uned arbrofol safonol ar gyfer yr astudiaeth llysiau'r afu. Cafwyd Gemma o blanhigion diwylliedig wedi'u sterileiddio ac yna'i blatio ar gyfrwng Gamborg B5 (Fujifilm Wako Pure Chemical) yn cynnwys 1% swcros a 0.3% gwm gellan a'i ddeori ar 23°C o dan olau parhaus.
Darparwyd celloedd tybaco BY-2 (Nicotiana tabacum L. cv. Bright Yellow 2) gan S. Hasezawa (Prifysgol Tokyo). Cafodd celloedd BY-2 eu gwanhau 95 gwaith mewn cyfrwng Linsmeier a Skoog wedi'i addasu ac ategu'n wythnosol ag asid 2,4-dichlorophenoxyacetic 32 . Cymysgwyd yr ataliad celloedd ar ysgwydwr cylchdro ar 130 rpm ar 27°C yn y tywyllwch. Golchwch y celloedd gyda 10 gwaith y gyfaint o gyfrwng ffres ac ail-ataliwch yn yr un cyfrwng. Cynhyrchwyd llinellau celloedd trawsgenig BY-2 sy'n mynegi'r marcwr microtubule TagRFP-TUA6 neu'r marcwr ffilament actin GFP-ABD2 yn sefydlog o dan hyrwyddwr firws mosaig blodfresych 35S fel y disgrifiwyd 33,34,35 . Gellir cynnal a chydamseru'r llinellau celloedd hyn gan ddefnyddio gweithdrefnau tebyg i'r rhai a ddefnyddiwyd ar gyfer y llinell gelloedd BY-2 wreiddiol.
Cafodd celloedd HeLa eu meithrin mewn cyfrwng Dulbecco's modified Eagle's (DMEM) (Life Technologies) wedi'i ategu â 10% o serwm ffetws buchol, 1.2 U/ml o benisilin, ac 1.2 μg/ml o streptomycin mewn deorydd 37°C gyda 5% CO2.
Perfformiwyd yr holl arbrawf a ddisgrifir yn y llawysgrif hon yn unol â rheoliadau a chanllawiau bioddiogelwch Japaneaidd.
Diddymwyd cyfansoddion mewn dimethyl sylffocsid (DMSO; Fujifilm Wako Pure Chemical) fel toddiannau stoc a'u gwanhau mewn cyfrwng MS ar gyfer Arabidopsis a thybaco neu gyfrwng Gamborg B5 ar gyfer llysiau'r afu. Ar gyfer yr assay atal twf gwreiddiau, heuwyd mwy na 10 had fesul plât ar gyfrwng agar yn cynnwys y cyfansoddion a nodwyd neu DMSO. Deorwyd yr hadau mewn siambr dwf am 7 diwrnod. Tynnwyd ffotograffau o'r eginblanhigion a mesurwyd hyd y gwreiddiau. Ar gyfer yr assay egino Arabidopsis, heuwyd 48 had fesul plât ar gyfrwng agar yn cynnwys 200 μM o gyfansoddyn neu DMSO. Tyfwyd hadau Arabidopsis mewn siambr dwf a chyfrifwyd nifer yr eginblanhigion a eginowyd 7 diwrnod ar ôl egino (dag). Ar gyfer yr assay egino tybaco, heuwyd 24 had fesul plât ar gyfrwng agar yn cynnwys 200 μM o KAND neu DMSO. Tyfwyd hadau tybaco mewn siambr dwf a chyfrifwyd nifer yr eginblanhigion a eginowyd ar ôl 14 diwrnod. Ar gyfer yr assay atal twf llysiau'r afu, platiwyd 9 embryo o bob plât ar gyfrwng agar yn cynnwys y crynodiadau a nodwyd o KAND neu DMSO a'u deori mewn siambr twf am 14 diwrnod.
Defnyddiwch eginblanhigion wedi'u staenio â 5 mg/ml o ïodid propidiwm (PI) i ddelweddu trefniadaeth meristem y gwreiddiau. Arsylwyd signalau PI trwy ficrosgopeg fflwroleuol gan ddefnyddio microsgop sganio laser confocal TCS SPE (Leica Microsystems).
Perfformiwyd staenio histochemegol gwreiddiau gyda β-glwcuronidase (GUS) yn ôl y protocol a ddisgrifiwyd gan Malami a Benfey36. Cafodd eginblanhigion eu gosod mewn aseton 90% dros nos, eu staenio â 0.5 mg/ml o asid 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-d-glwcuronig mewn byffer GUS am 1 awr a'u rhoi mewn toddiant cloraldehyd hydradol. (8 g o hydrad cloral, 2 ml o ddŵr ac 1 ml o glyserol) a'u harsylwi trwy ficrosgopeg cyferbyniad ymyrraeth wahaniaethol gan ddefnyddio microsgop Axio Imager M1 (Carl Zeiss).
Mesurwyd onglau gwreiddiau ar eginblanhigion 7 diwrnod oed a dyfwyd ar blatiau wedi'u gosod yn fertigol. Mesurwch ongl y gwreiddyn o gyfeiriad y fector disgyrchiant fel y disgrifiwyd yng ngham 6.
Arsylwyd trefniant y microdiwbynnau cortigol fel y disgrifiwyd, gyda mân addasiadau i'r protocol 37. Defnyddiwyd gwrthgorff gwrth-β-tiwbiwlin (KMX-1, Merk Millipore: MAB3408) ac IgG gwrth-lygoden cysylltiedig ag Alexa Fluor 488 (Thermo Fisher Scientific: A32723) fel gwrthgyrff cynradd ac eilaidd ar wanhadau 1:1000 ac 1:100, yn y drefn honno. Cafwyd delweddau fflwroleuedd gan ddefnyddio microsgop sganio laser confocal TCS SPE (Leica Microsystems). Cafwyd delweddau Z-stack a chreu tafluniadau dwyster mwyaf yn unol â chyfarwyddiadau'r gwneuthurwr.
Perfformiwyd assay amlhau celloedd HeLa gan ddefnyddio Pecyn Cyfrif Celloedd 8 (Dojindo) yn unol â chyfarwyddiadau'r gwneuthurwr.
Dadansoddwyd twf E. coli DH5α drwy fesur dwysedd celloedd mewn diwylliant gan ddefnyddio sbectroffotomedr ar 600 nm (OD600).
Arsylwyd trefniadaeth cytosgerbydol mewn celloedd BY-2 trawsgenig gan ddefnyddio microsgop fflwroleuol a oedd â dyfais sganio confocal CSU-X1 (Yokogawa) a chamera sCMOS (Zyla, Andor Technology). Aseswyd dwysedd cytosgerbydol trwy ddadansoddi delweddau, a fesurodd ganran y picseli cytosgerbydol ymhlith picseli cytoplasmig mewn delweddau confocal gan ddefnyddio meddalwedd ImageJ fel y disgrifiwyd38,39.
I ganfod marwolaeth celloedd mewn celloedd BY-2, cafodd rhan o'r ataliad celloedd ei ddeori gyda 0.05% o las Evans am 10 munud ar dymheredd ystafell. Mae staenio glas Evans detholus o gelloedd marw yn dibynnu ar allwthio'r llifyn o gelloedd hyfyw gan y bilen plasma gyfan40. Arsylwyd celloedd wedi'u staenio gan ddefnyddio microsgop maes llachar (BX53, Olympus).
Tyfwyd celloedd HeLa mewn DMEM wedi'i ategu â 10% FBS mewn deorydd lleithder ar 37°C a 5% CO2. Cafodd celloedd eu trin â 100 μM KAND 11, asid kumamonamig 6, kumamonamid 1, 100 ng/ml colcemid (Gibco), neu 100 ng/ml Nocodmaze (Sigma) am 6 awr ar 37°C. Cafodd celloedd eu trwsio â MetOH am 10 munud ac yna gydag asetat am 5 munud ar dymheredd ystafell. Cafodd celloedd sefydlog eu deori â gwrthgorff cynradd β-tiwbiwlin (1D4A4, Proteintech: 66240-1) wedi'i wanhau mewn 0.5% BSA/PBS am 2 awr, eu golchi 3 gwaith gyda TBST, ac yna eu deori â gwrthgorff gafr Alexa Fluor. 488 1 awr. – IgG llygoden (Thermo Fisher Scientific: A11001) a 15 ng/ml 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) wedi'i wanhau mewn 0.5% BSA/PBS. Ar ôl golchi â TBST dair gwaith, gwelwyd celloedd wedi'u lliwio ar ficrosgop gwrthdro Nikon Eclipse Ti-E. Cipiwyd delweddau gyda chamera CCD Hamamatsu ORCA-R2 wedi'i oeri gan ddefnyddio meddalwedd MetaMorph (Molecular Devices).
Amser postio: 17 Mehefin 2024