Diolch am ymweld â Nature.com.Mae gan y fersiwn o'r porwr rydych chi'n ei ddefnyddio gefnogaeth CSS gyfyngedig.I gael y canlyniadau gorau, rydym yn argymell eich bod yn defnyddio fersiwn mwy diweddar o'ch porwr (neu analluogi Modd Cydnawsedd yn Internet Explorer).Yn y cyfamser, er mwyn sicrhau cefnogaeth barhaus, rydym yn dangos y wefan heb steilio na JavaScript.
Gall darganfod a defnydd buddiol o gynhyrchion naturiol helpu i wella bywyd dynol.Defnyddir cemegau atal twf planhigion yn eang fel chwynladdwyr i reoli chwyn.Oherwydd yr angen i ddefnyddio gwahanol fathau o chwynladdwyr, mae angen nodi cyfansoddion gyda mecanweithiau gweithredu newydd.Yn yr astudiaeth hon, fe wnaethom ddarganfod cyfansawdd N -alkoxypyrrole nofel, coumamonamide, o Streptomyces werraensis MK493-CF1 a sefydlu'r broses synthesis gyflawn.Trwy brofion gweithgaredd biolegol, fe wnaethom ddarganfod bod asid urs-monoamig yn ganolradd synthetig o urs-monoamid ac yn botensialatalydd twf planhigion.Yn ogystal, rydym wedi datblygu amrywiol ddeilliadau asid urbenonig, gan gynnwys y deilliad urbenyloxy (UDA), sydd â gweithgaredd chwynladdol uchel heb effeithio'n negyddol ar dwf celloedd HeLa.Gwelsom hefyd fod deilliadau asid urmotonig yn amharu ar ficrodiwbiau planhigion;yn ogystal, mae KAND yn effeithio ar ffilamentau actin ac yn achosi marwolaeth celloedd;Mae'r effeithiau amlochrog hyn yn wahanol i effeithiau atalyddion microtiwbyn hysbys ac yn awgrymu mecanwaith gweithredu newydd ar gyfer asid ursonic, sy'n cynrychioli mantais bwysig yn natblygiad chwynladdwyr newydd.
Mae darganfod a chymhwyso cynhyrchion naturiol buddiol a'u deilliadau yn ymarferol yn fodd o wella ansawdd bywyd dynol.Mae metabolion eilaidd a gynhyrchir gan ficro-organebau, planhigion a phryfed wedi arwain at ddatblygiadau mawr mewn meddygaeth ac amaethyddiaeth.Mae llawer o wrthfiotigau a chyffuriau gwrth-lewcemia wedi'u datblygu o gynhyrchion naturiol.Yn ogystal, mae gwahanol fathau oplaladdwyr, ffwngladdiadau a chwynladdwyr yn cael eu tynnu o'r cynhyrchion naturiol hyn i'w defnyddio mewn amaethyddiaeth.Yn benodol, mae chwynladdwyr rheoli chwyn yn offer pwysig ar gyfer cynyddu cynnyrch cnydau mewn amaethyddiaeth fodern, ac mae gwahanol fathau o gyfansoddion eisoes yn cael eu defnyddio'n fasnachol.Mae nifer o brosesau cellog mewn planhigion, megis ffotosynthesis, metaboledd asid amino, synthesis wal gell, rheoleiddio mitosis, signalau ffytohormon, neu synthesis protein, yn cael eu hystyried yn dargedau nodweddiadol o chwynladdwyr.Mae cyfansoddion sy'n atal gweithrediad microtiwbyn yn ddosbarth cyffredin o chwynladdwyr sy'n effeithio ar dyfiant planhigion trwy effeithio ar reoleiddio mitotig2.
Mae microdiwbylau yn gydrannau o'r sytosgerbwd ac yn cael eu cadw'n eang mewn celloedd ewcaryotig.Mae'r heterodimer tubulin yn cynnwys α-tubulin a β-tubulin sy'n ffurfio protofilamentau microtiwbwl llinol, gyda 13 protofilament yn ffurfio strwythur silindrog.Mae microtiwbyn yn chwarae rolau lluosog mewn celloedd planhigion, gan gynnwys pennu siâp celloedd, cellraniad, a chludiant mewngellol3,4.Mae celloedd planhigion yn cynnwys microtiwbiau o dan y bilen plasma rhyngffas, a chredir bod y microtiwbwlau cortigol hyn, fel y'u gelwir, yn rheoli trefniadaeth microffibrilau cellwlos trwy reoleiddio cyfadeiladau synthase cellwlos4,5.Mae microtubules cortical o gelloedd epidermaidd gwraidd, sy'n bresennol yn y parth o elongation cyflym y blaen gwraidd, wedi'u lleoli yn ochrol, ac mae microffibrau cellwlos yn dilyn y microtiwbwlau hyn ac yn cyfyngu ar gyfeiriad ehangu celloedd, a thrwy hynny hyrwyddo elongation cell anisotropic.Felly, mae swyddogaeth microtubule yn perthyn yn agos i morffoleg planhigion.Mae amnewidion asid amino mewn genynnau sy'n amgodio twbwlin yn achosi gogwydd o araeau microtiwbwl cortigol a thwf ochr chwith neu dde yn Arabidopsis 6,7.Yn yr un modd, gall mwtaniadau mewn proteinau sy'n gysylltiedig â microtiwb sy'n rheoleiddio dynameg microtiwb hefyd arwain at dyfiant gwreiddiau ystumiedig8,9,10,11,12,13.Yn ogystal, mae trin chwynladdwyr sy'n tarfu ar ficrotiwbyl fel disopyramid, a elwir hefyd yn pretilachlor, hefyd yn achosi twf gwreiddiau lletraws yr ochr chwith14.Mae'r data hyn yn dangos bod rheoleiddio union swyddogaeth microtiwb yn hanfodol ar gyfer pennu cyfeiriad twf planhigion.
Mae gwahanol fathau o atalyddion microtiwb wedi'u darganfod, ac mae'r cyffuriau hyn wedi gwneud cyfraniadau sylweddol i ymchwil syto-ysgerbydol, yn ogystal ag amaethyddiaeth a meddygaeth2.Yn benodol, gall oryzalin, cyfansoddion dinitroaniline, disopyramid, cyfansoddion sy'n gysylltiedig â benzamid, a'u analogau atal swyddogaeth microtiwbyn a thrwy hynny atal twf planhigion.Felly, fe'u defnyddir yn helaeth fel chwynladdwyr.Fodd bynnag, gan fod microtiwbiau yn elfen bwysig o gelloedd planhigion ac anifeiliaid, mae'r rhan fwyaf o atalyddion microtiwbyn yn sytotocsig i'r ddau fath o gell.Felly, er gwaethaf eu defnyddioldeb cydnabyddedig fel chwynladdwyr, defnyddir nifer gyfyngedig o gyfryngau gwrthficrotibwl at ddibenion ymarferol.
Mae Streptomyces yn genws o'r teulu Streptomyces, sy'n cynnwys bacteria aerobig, gram-bositif, ffilamentaidd ac mae'n adnabyddus am ei allu i gynhyrchu ystod eang o fetabolion eilaidd.Felly, fe'i hystyrir yn un o'r ffynonellau pwysicaf o gynhyrchion naturiol newydd sy'n weithredol yn fiolegol.Yn yr astudiaeth gyfredol, fe wnaethom ddarganfod cyfansoddyn newydd o'r enw coumamonamide, a oedd wedi'i ynysu o Streptomyces werraensis MK493-CF1 a S. werraensis ISP 5486. Gan ddefnyddio dadansoddiad sbectrol a dadansoddiad sbectrol llawn, nodweddwyd strwythur coumamonamide a'i sgerbwd N-alkoxypyrrole unigryw yn benderfynol.synthesis.Canfuwyd bod asid Ursmonic, canolradd synthetig o ursmonoamide a'i ddeilliadau, yn atal twf ac egino'r planhigyn model poblogaidd Arabidopsis thaliana.Mewn astudiaeth perthynas strwythur-gweithgaredd, canfuom fod cyfansawdd gyda C9 wedi'i addasu i asid ursonic, o'r enw deilliad nonyloxy o asid ursonic (KAND), yn gwella'n sylweddol yr effaith ataliol ar dwf ac egino.Yn nodedig, roedd yr atalydd twf planhigion newydd ei ddarganfod hefyd yn effeithio ar dwf tybaco a llysiau'r afu ac nid oedd yn sytotocsig i facteria na chelloedd HeLa.Ar ben hynny, mae rhai deilliadau asid wrmotonig yn achosi ffenoteip gwraidd ystumiedig, sy'n awgrymu bod y deilliadau hyn yn effeithio'n uniongyrchol neu'n anuniongyrchol ar ficrotiwbwlau.Yn gyson â'r syniad hwn, mae ein harsylwadau o ficrodiwbynnau sydd wedi'u labelu naill ai'n imiwn-histocemegol neu â phroteinau fflwroleuol yn dangos bod triniaeth KAND yn dadbolymereiddio microtiwbwlau.Yn ogystal, roedd triniaeth â deilliadau asid kumamotonig yn tarfu ar ficrofilamentau actin.Felly, rydym wedi darganfod atalydd twf planhigion newydd y mae ei fecanwaith gweithredu unigryw yn cynnwys dinistrio'r cytoskeleton.
Cafodd straen MK493-CF1 ei ynysu o bridd yn Shinagawa-ku, Tokyo.Straen MK493-CF1 ffurfio myseliwm stromal cangen dda.Penderfynwyd ar ddilyniant rhannol y genyn RNA ribosomaidd 16S (1422 bp).Mae'r straen hwn yn debyg iawn i S. werraensis (NBRC 13404T = ISP 5486, 1421/1422 bp, T: straen nodweddiadol, 99.93%).Yn seiliedig ar y canlyniad hwn, penderfynwyd bod cysylltiad agos rhwng y straen hwn a math o straen S. werraensis.Felly, fe wnaethom enwi'r straen hwn dros dro S. werraensis MK493-CF1.Mae S. werraensis ISP 5486T hefyd yn cynhyrchu'r un cyfansoddion bioactif.Gan nad oedd llawer o ymchwil cynnar i gael cynhyrchion naturiol o'r micro-organeb hwn, cynhaliwyd ymchwil cemegol pellach.Ar ôl tyfu S. werraensis MK493-CF1 ar gyfrwng haidd trwy eplesu cyflwr solet ar 30 ° C am 14 diwrnod, echdynnwyd y cyfrwng gyda 50% EtOH.Sychwyd 60 ml o sampl i gael 59.5 mg o echdyniad crai.Roedd y dyfyniad crai yn destun cam gwrthdroi HPLC i roi N-methoxy-1H-pyrrole-2-carboxamide (1, a enwyd coumamonamide, 36.0 mg).Mae cyfanswm o 1 tua 60% o'r darn crai.Felly, penderfynasom astudio priodweddau kumamotoamide 1 yn fanwl.
Mae Coumamonamide 1 yn bowdr amorffaidd gwyn ac mae sbectrometreg màs cydraniad uchel (HRESIMS) yn cadarnhau C6H8N2O2 (Ffig. 1).Nodweddir y darn pyrrole o'r cyfansoddyn hwn a amnewidiwyd gan C2 gan δH 6.94 (1H, t, J = 2.8, 4.8 Hz, H-4), δH 6.78 (1H, d, J = 2.5, δH mewn sbectrwm 1H NMR: 4.5 Hz , H-5) a δH 6.78 (1H, d, J = 2.5 Hz, H-6), ac mae'r sbectrwm 13C NMR yn dangos presenoldeb pedwar atom carbon sp2.Aseswyd presenoldeb grŵp amid yn y safle C2 gan gydberthynas HMBC o'r proton C-3 i'r carbonyl carbonyl amid ar δC 161.1.Yn ogystal, mae copaon NMR 1 H a 13 C yn δH 4.10 (3H, S) ac δC 68.3 yn nodi presenoldeb grwpiau N-methocsi yn y moleciwl.Er nad oedd lleoliad cywir y grŵp methoxy wedi'i bennu eto gan ddefnyddio dadansoddiad sbectrosgopig fel sbectrosgopeg gwahaniaeth gwell a thalfyriad Overhauser niwclear (NOEDF), daeth N-methoxy-1H-pyrrole-2-carboxamide yn gyfansoddyn ymgeisydd cyntaf.
Er mwyn pennu strwythur cywir 1, perfformiwyd synthesis cyfan (Ffig. 2a).Arweiniodd trin 2-aminopyridin 2 sydd ar gael yn fasnachol gyda m-CPBA at y N-ocsid 3 cyfatebol mewn cynnyrch meintiol.Ar ôl y 2-aminoazidation o 2, cynhaliwyd yr adwaith cyclocondensation a ddisgrifiwyd gan Abramovich mewn bensen ar 90 ° C i gael yr 1-hydroxy-1H-pyrrole-2-carbonitrile 5 a ddymunir mewn gramau.Cyflymder 60% (dau gam).15,16.Yna rhoddodd methylation a hydrolysis 4 1-methoxy-1H-pyrrole-2-carboxylic acid (a elwir yn “asid cwmotonig”, 6) mewn cynnyrch da (70%, dau gam).Yn olaf, rhoddodd amideiddio trwy asid clorid canolradd 6 gan ddefnyddio amonia dyfrllyd gynnyrch Kumamoto amide 1 mewn 98%.Roedd holl ddata sbectrol 1 wedi'i syntheseiddio yn debyg i ynysig 1, felly penderfynwyd strwythur 1;
Synthesis cyffredinol a dadansoddiad o weithgaredd biolegol urbenamide ac asid wrbenig.(a) Cyfanswm synthesis Kumamoto amide.(b) Tyfwyd eginblanhigion Arabidopsis Columbia (Col) gwyllt saith niwrnod oed ar blatiau Murashige a Skoog (MS) yn cynnwys coumamonamide 6 neu coumamonamide 1 yn y crynodiadau a nodwyd.Bar graddfa = 1 cm.
Yn gyntaf, fe wnaethom asesu gweithgareddau biolegol urbenamid a'i ganolraddau ar gyfer eu gallu i fodiwleiddio twf planhigion.Fe wnaethom ychwanegu crynodiadau amrywiol o ursmonamide 1 neu asid ursmonig 6 at eginblanhigion cyfrwng agar MS a diwylliedig Arabidopsis thaliana ar y cyfrwng hwn.Dangosodd y profion hyn fod crynodiadau uchel (500 μM) o 6 yn atal tyfiant gwreiddiau (Ffig. 2b).Nesaf, fe wnaethom gynhyrchu gwahanol ddeilliadau trwy amnewid safle N1 o 6 a pherfformio astudiaethau perthynas strwythur-gweithgaredd arnynt (disgrifir y broses synthesis analog yn y Gwybodaeth Ategol (SI)).Tyfwyd eginblanhigion Arabidopsis ar gyfrwng sy'n cynnwys 50 μM deilliadau asid ursonic, a mesurwyd hyd gwreiddiau.fel y dangosir ar y llun.Fel y dangosir yn Ffigurau 3a, b, ac S1, mae gan asidau coumamo wahanol hyd o gadwyni alcocsi llinol (9, 10, 11, 12, a 13) neu gadwyni alcocsi mawr (15, 16, a 17) yn y safle N1.Dangosodd y deilliadau ataliad sylweddol o dyfiant gwreiddiau.Yn ogystal, canfuom fod cymhwyso 200 μM 10, 11, neu 17 yn atal egino (Ffig. 3c a S2).
Astudiaeth o berthynas strwythur-gweithgaredd Kumamoto amide a chyfansoddion cysylltiedig.(a) Adeiledd a chynllun synthesis analogau.(b) Meintioli hyd gwreiddiau eginblanhigion 7 diwrnod oed a dyfwyd ar gyfrwng MS gyda neu heb ddeilliadau coumamonamide 50 μM.Mae seren yn dangos gwahaniaethau sylweddol gyda thriniaeth ffug (prawf t, t< 0.05).n>18. Dangosir data fel cymedr ± SD.nt yn golygu “heb ei brofi” oherwydd ni wnaeth mwy na 50% o'r hadau egino.(c) Meintioli cyfradd egino hadau wedi'u trin a ddeorwyd am 7 diwrnod mewn cyfrwng MS gyda neu heb 200 μM coumamonamide a chyfansoddion cysylltiedig.Mae seren yn dangos gwahaniaethau sylweddol gyda thriniaeth ffug (prawf chi-sgwâr).n=96.
Yn ddiddorol, roedd ychwanegu cadwyni ochr alcyl yn hirach na C9 yn lleihau'r gweithgaredd ataliol, gan awgrymu bod angen cadwyni ochr o faint penodol ar gyfansoddion sy'n gysylltiedig ag asid kumamotoig i arddangos eu gweithgaredd biolegol.
Oherwydd bod dadansoddiad o berthynas strwythur-gweithgaredd yn dangos bod C9 wedi'i addasu i asid ursonic a'r deilliad nonyloxy o asid ursonic (y cyfeirir ato o hyn ymlaen fel KAND 11) oedd yr atalydd twf planhigion mwyaf effeithiol, cynhaliwyd nodweddiad manylach o KAND 11. Trin Arabidopsis gyda 50 μM KAND 11 bron yn atal egino yn gyfan gwbl, tra bod crynodiadau is (40, 30, 20, neu 10 μM) o KAND 11 yn atal twf gwreiddiau mewn modd sy'n dibynnu ar ddos (Ffig. 4a, b).Er mwyn profi a yw KAND 11 yn effeithio ar hyfywedd meristem gwreiddiau, archwiliwyd meristemau gwreiddiau wedi'u staenio â propidium ïodid (PI) a mesurwyd maint ardal meristem.Maint y meristem o eginblanhigion a dyfwyd ar gyfrwng sy'n cynnwys 25 μM KAND-11 oedd 151.1 ± 32.5 μm, tra bod maint y meristem o eginblanhigion a dyfwyd ar gyfrwng rheoli sy'n cynnwys DMSO yn 264.7 ± 30.8 μm (Ffig d). , sy'n dangos bod KAND-11 yn adfer gweithgaredd cellog.ymledu.meristem gwraidd.Yn gyson â hyn, gostyngodd triniaeth KAND 11 faint o farciwr cellraniad CDKB2; 1c::CDKB2; signal 1-GUS yn y meristem gwraidd (Ffig. 4e) 17 .Mae'r canlyniadau hyn yn dangos bod KAND 11 yn atal twf gwreiddiau trwy leihau gweithgaredd amlhau celloedd.
Dadansoddiad o effaith ataliol deilliadau asid urbenonig (deilliadau urbenyloxy) ar dwf.(a) Eginblanhigion math gwyllt 7 diwrnod oed Col a dyfir ar blatiau MS gyda'r crynodiadau a nodir o KAND 11. Bar graddfa = 1 cm.(b) Meintioli hyd gwreiddyn.Mae llythyrau yn nodi gwahaniaethau arwyddocaol (prawf HSD Tukey, t< 0.05).n>16. Dangosir data fel cymedr ± SD.(c) Microsgopeg cydffocal o wreiddiau Col tebyg i staen ïodid gwyllt a dyfir ar blatiau MS gyda neu heb 25 μM KAND 11. Mae cromfachau gwyn yn dynodi meristem gwraidd.Bar graddfa = 100 µm.(d) Meintioli maint gwreiddyn meristem (n = 10 i 11).Canfuwyd gwahaniaethau ystadegol gan ddefnyddio prawf-t (t< 0.05).Mae'r bariau'n cynrychioli maint cyfartalog meristem.(d) Microsgopeg cyferbyniad ymyrraeth wahaniaethol (DIC) o meristem gwraidd sy'n cynnwys lluniad CDKB2;1pro: CDKB2;1-GUS wedi'i staenio a'i staenio ar eginblanhigion 5 diwrnod oed a dyfir ar blatiau MS gyda neu heb assay 25 µM KAND.
Profwyd ffytowenwyndra KAND 11 ymhellach gan ddefnyddio planhigyn dicotyledonous arall, tybaco (Nicotiana tabacum), ac organeb model planhigyn tir mawr, llysiau'r afu (Marchantia polymorpha).Fel yn achos Arabidopsis, cynhyrchodd eginblanhigion tybaco SR-1 a dyfwyd ar gyfrwng sy'n cynnwys 25 μM KAND 11 wreiddiau byrrach (Ffig. 5a).Yn ogystal, eginodd 40 o 48 o hadau ar blatiau a oedd yn cynnwys 200 μM KAND 11, tra bod pob un o'r 48 o hadau'n egino ar gyfryngau ffug, gan nodi bod crynodiadau uwch o KAND yn sylweddol (t.< 0.05;chi test -square) atal egino tybaco.(Ffig. 5b).Yn ogystal, roedd y crynodiad o KAND 11 a oedd yn atal twf bacteriol mewn llysiau'r afu yn debyg i'r crynodiad effeithiol yn Arabidopsis (Ffig. 5c).Mae'r canlyniadau hyn yn dangos y gall KAND 11 atal twf amrywiaeth o blanhigion.Yna fe wnaethom ymchwilio i sytowenwyndra posibl cyfansoddion sy'n gysylltiedig â monoamid arth mewn organebau eraill, sef celloedd HeLa dynol a straen Escherichia coli DH5α, fel cynrychiolwyr celloedd anifeiliaid a bacteriol uwch, yn y drefn honno.Mewn cyfres o brofion amlhau celloedd, gwelsom nad oedd coumamonamide 1, asid coumamonamidic 6, a KAND 11 yn effeithio ar dwf celloedd HeLa neu E. coli mewn crynodiadau o 100 μM (Ffig. 5d,e).
Atal twf KAND 11 mewn organebau nad ydynt yn Arabidopsis.(a) Tyfwyd eginblanhigion tybaco SR-1 gwyllt dwy wythnos oed ar blatiau MS wedi'u lleoli'n fertigol a oedd yn cynnwys 25 μM KAND 11. (b) Tyfwyd eginblanhigion tybaco math SR-1 gwyllt pythefnos oed ar leoliad llorweddol Platiau MS sy'n cynnwys 200 μM KAND 11. (c) Blagur llysiau'r afu tebyg i wyllt Tak-1 pythefnos oed a dyfwyd ar blatiau Gamborg B5 gyda'r crynodiadau a nodir o KAND 11. Mae saethau coch yn dynodi sborau a roddodd y gorau i dyfu o fewn y cyfnod magu pythefnos cyfnod.(d) Assay amlhau celloedd o gelloedd HeLa.Mesurwyd nifer y celloedd hyfyw ar gyfnodau amser penodol gan ddefnyddio pecyn cyfrif celloedd 8 (Dojindo).Fel rheolaeth, cafodd celloedd HeLa eu trin â 5 μg / ml actinomycin D (Deddf D), sy'n atal trawsgrifio RNA polymeras ac yn achosi marwolaeth celloedd.Cynhaliwyd dadansoddiadau triphlyg.(e) Assay amlhau celloedd E. coli.Dadansoddwyd twf E. coli trwy fesur OD600.Fel rheolaeth, cafodd celloedd eu trin â 50 μg/ml ampicillin (Amp), sy'n atal synthesis cellfuriau bacteriol.Cynhaliwyd dadansoddiadau triphlyg.
Er mwyn dehongli mecanwaith gweithredu cytotocsigedd a achosir gan gyfansoddion sy'n gysylltiedig â wramid, fe wnaethom ail-ddadansoddi deilliadau asid urbenig ag effeithiau ataliol cymedrol.fel y dangosir ar y llun.Fel y dangosir yn Ffigurau 2b, 6a, cynhyrchodd eginblanhigion a dyfwyd ar blatiau agar sy'n cynnwys crynodiadau uchel (200 μM) o asid urmotonig 6 wreiddiau byrrach a chrwm chwith (θ = - 23.7 ± 6.1), tra o eginblanhigion a dyfwyd ar y cyfrwng rheoli, y eginblanhigion yn cynhyrchu gwreiddiau bron yn syth (θ = – 3.8 ± 7.1).Mae'n hysbys bod y tyfiant lletraws nodweddiadol hwn yn deillio o gamweithrediad microtubules cortigol14,18.Yn gyson â'r canfyddiad hwn, roedd y cyffuriau ansefydlogi microtiwbyn disopyramide ac oryzalin yn achosi gogwyddo gwreiddiau tebyg o dan ein hamodau twf (Ffig. 2b, 6a).Ar yr un pryd, gwnaethom brofi deilliadau asid urmotonig a dewiswyd nifer ohonynt a oedd, ar grynodiadau penodol, yn achosi twf gwreiddiau lletraws.Newidiodd cyfansoddion 8, 9, a 15 gyfeiriad twf gwreiddiau yn 75 μM, 50 μM, a 40 μM, yn y drefn honno, gan nodi y gall y cyfansoddion hyn ansefydlogi microtubules yn effeithiol (Ffig. 2b, 6a).Fe wnaethom hefyd brofi'r deilliad asid wrsolig mwyaf grymus, KAND 11, ar grynodiad is (15 µM) a chanfod bod cymhwyso KAND 11 yn atal twf gwreiddiau a bod cyfeiriad twf gwreiddiau yn anwastad, er eu bod yn tueddu i oleddu i'r chwith ( Ffigur C3)..Oherwydd bod crynodiadau uwch o gyffuriau ansefydlogi microtiwb weithiau'n atal tyfiant planhigion yn hytrach nag achosi gogwyddo gwreiddiau, fe wnaethom wedyn asesu'r posibilrwydd bod KAND 11 yn effeithio ar ficrotiwbwles trwy arsylwi microtiwbwlau cortigol mewn celloedd gwraidd epidermaidd.Dangosodd imiwnohistochemistry gan ddefnyddio gwrthgyrff gwrth-β-tiwbwlin mewn celloedd epidermaidd o wreiddiau eginblanhigion drin â 25 μM KAND 11 ddiflaniad bron pob microtubules cortical mewn celloedd epidermaidd yn y parth elongation (Ffig. 6b).Mae'r canlyniadau hyn yn dangos bod asid kumamotonig a'i ddeilliadau'n gweithredu'n uniongyrchol neu'n anuniongyrchol ar ficrodiwbynnau i darfu arnynt a bod y cyfansoddion hyn yn atalyddion microtiwbyn newydd.
Mae asid Ursonig a'i ddeilliadau yn newid microdiwbynnau cortigol yn Arabidopsis thaliana.(a) Ongl goledd y gwreiddiau wedi'i mesur ym mhresenoldeb gwahanol ddeilliadau asid wrmotonig yn y crynodiadau a nodir.Dadansoddwyd hefyd effeithiau dau gyfansoddyn y gwyddys eu bod yn atal microtiwbwl: disopyramide ac oryzalin.Mae'r mewnosodiad yn dangos y safon a ddefnyddir i fesur ongl twf gwreiddiau.Mae seren yn dangos gwahaniaethau sylweddol gyda thriniaeth ffug (prawf t, t< 0.05).n>19. Bar graddfa = 1 cm.(b) Microtiwbiau cortigol mewn celloedd epidermaidd yn y parth elongation.Delweddwyd microtiwbwlau mewn gwreiddiau gwyllt Arabidopsis Col a dyfwyd ar blatiau MS gyda neu heb 25 μM KAND 11 trwy staenio imiwn-histocemegol gan ddefnyddio gwrthgyrff cynradd β-tiwbwlin a gwrthgyrff eilaidd wedi'u cyfuno â Alexa Fluor.Bar graddfa = 10 µm.(c) Adeiledd mitotig microdiwbylau yn y meristem gwraidd.Delweddwyd microtubules gan ddefnyddio staenio imiwn-histocemegol.Cafodd strwythurau mitotig, gan gynnwys parthau proffas, gwerthydau, a phragmoplastau, eu cyfrif o ddelweddau confocal.Mae saethau'n dangos strwythurau microtiwb mitotig.Mae seren yn dangos gwahaniaethau sylweddol gyda thriniaeth ffug (prawf t, t< 0.05).n>9. Bar graddfa = 50 µm.
Er bod gan Ursa y gallu i darfu ar swyddogaeth microtiwbwl, disgwylir i'w fecanwaith gweithredu fod yn wahanol i gyfryngau depolymerizing microtiwbwl nodweddiadol.Er enghraifft, mae crynodiadau uwch o gyfryngau depolymerizing microtiwb fel disopyramide ac oryzalin yn ysgogi ehangu anisotropig celloedd epidermaidd, ond nid yw KAND 11 yn gwneud hynny.Yn ogystal, arweiniodd cyd-gymhwyso KAND 11 a disopyramide at ymateb twf gwreiddiau cyfunol a achosir gan disopyramid a gwelwyd ataliad twf a achosir gan KAND 11 ( Ffig. S4 ).Fe wnaethom hefyd ddadansoddi ymateb y mutant disopyramid hypersensitive 1-1 (phs1-1) i KAND 11. Mae gan phs1-1 fwtaniad pwynt kinase tubulin an-ganonaidd ac mae'n cynhyrchu gwreiddiau byrrach pan gaiff ei drin â disopyramide9,20.phs1-1 eginblanhigion mutant tyfu ar gyfrwng agar sy'n cynnwys KAND 11 roedd gwreiddiau byrrach yn debyg i'r rhai a dyfir ar disopyramid (ffig. S5).
Yn ogystal, gwelsom adeileddau microtiwbwl mitotig, megis parthau prophase, gwerthydau, a phragmoplastau, ym meristem gwraidd eginblanhigion wedi'u trin â KAND 11. Yn gyson â'r arsylwadau ar gyfer CDKB2; 1c::CDKB2; 1-GUS, gostyngiad sylweddol mewn sylwyd ar nifer y microtiwbwlau mitotig (Ffig. .6c).
Er mwyn nodweddu sytowenwyndra KAND 11 ar gydraniad isgellog, gwnaethom drin celloedd crog BY-2 tybaco gyda KAND 11 a gwelsom eu hymateb.Yn gyntaf, fe wnaethom ychwanegu KAND 11 at gelloedd BY-2 sy'n mynegi TagRFP-TUA6, sy'n labelu microtiwbwlau yn fflwroleuol, i asesu effaith KAND 11 ar ficrodiwbynnau cortigol.Aseswyd dwysedd microtiwbyn cortigol gan ddefnyddio dadansoddiad delwedd, a fesurodd ganran y picsel cytosgerbydol ymhlith picseli cytoplasmig.Dangosodd y canlyniadau assay, ar ôl triniaeth â 50 μM neu 100 μM KAND 11 am 1 awr, fod y dwysedd wedi gostwng yn sylweddol i 0.94 ± 0.74% neu 0.23 ± 0.28%, yn y drefn honno, tra bod dwysedd y celloedd a gafodd eu trin â DMSO, yn dod i gyfanswm o 1.63 ± 1.63 ± 0.28%. % (Ffig. 7a).Mae'r canlyniadau hyn yn gyson â'r arsylwi yn Arabidopsis bod triniaeth KAND 11 yn cymell depolymerization microtiwbwlau cortigol (Ffig. 6b).Fe wnaethom hefyd archwilio llinell BY-2 gyda ffilamentau actin wedi'u labelu gan GFP-ABD ar ôl triniaeth gyda'r un crynodiad o KAND 11 a gwelsom fod triniaeth KAND 11 wedi amharu ar y ffilamentau actin.Roedd triniaeth â 50 μM neu 100 μM KAND 11 am 1 h yn lleihau dwysedd ffilament actin yn sylweddol i 1.20 ± 0.62% neu 0.61 ± 0.26%, yn y drefn honno, tra bod y dwysedd mewn celloedd a driniwyd gan DMSO yn 1.69 ± 0.51 % (F).7b).Mae'r canlyniadau hyn yn cyferbynnu ag effeithiau propyzamide, nad yw'n effeithio ar ffilamentau actin, a latrunculin B, depolymerizer actin nad yw'n effeithio ar ficrotiwbwles (SI Ffigur S6).Yn ogystal, nid oedd triniaeth â coumamonamide 1, asid coumamonamide 6, neu KAND 11 yn effeithio ar ficrotubules mewn celloedd HeLa (SI Ffigur S7).Felly, credir bod mecanwaith gweithredu KAND 11 yn wahanol i fecanwaith aflonyddwyr cytoskeleton hysbys.Yn ogystal, datgelodd ein harsylwad microsgopig o gelloedd BY-2 a gafodd eu trin â KAND 11 ddechrau marwolaeth celloedd yn ystod triniaeth KAND 11 a dangosodd nad oedd cyfran celloedd marw lliw glas Evans wedi cynyddu'n sylweddol ar ôl 30 munud o driniaeth KAND 11, tra ar ôl 90 munud o driniaeth gyda 50 μM neu 100 μM KAND, cynyddodd nifer y celloedd marw i 43.7% neu 80.1%, yn y drefn honno (Ffig. 7c).Gyda'i gilydd, mae'r data hyn yn dangos bod y deilliad asid wrsolig newydd KAND 11 yn atalydd sytosgerbydol planhigion-benodol gyda mecanwaith gweithredu anhysbys yn flaenorol.
Mae KAND yn effeithio ar ficrotiwbwlau cortigol, ffilamentau actin, a hyfywedd celloedd tybaco BY-2.(a) Delweddu microtiwbwlau cortigol mewn celloedd BY-2 ym mhresenoldeb TagRFP-TUA6.Archwiliwyd celloedd BY-2 a gafodd eu trin â KAND 11 (50 μM neu 100 μM) neu DMSO gan ficrosgopeg confocal.Cyfrifwyd dwysedd microtiwbwl cortigol o ficrograffau o 25 o gelloedd annibynnol.Mae llythyrau yn nodi gwahaniaethau arwyddocaol (prawf HSD Tukey, t< 0.05).Bar graddfa = 10 µm.(b) Ffilamentau actin cortigol mewn celloedd BY-2 wedi'u delweddu ym mhresenoldeb GFP-ABD2.Archwiliwyd celloedd BY-2 a gafodd eu trin â KAND 11 (50 μM neu 100 μM) neu DMSO gan ficrosgopeg confocal.Cyfrifwyd dwysedd ffilamentau actin cortigol o ficrograffau o 25 o gelloedd annibynnol.Mae llythyrau yn nodi gwahaniaethau arwyddocaol (prawf HSD Tukey, t< 0.05).Bar graddfa = 10 µm.(c) Arsylwi celloedd marw BY-2 gan Evans wedi'i staenio'n las.Archwiliwyd celloedd BY-2 a gafodd eu trin â KAND 11 (50 μM neu 100 μM) neu DMSO gan ficrosgopeg maes llachar.n=3.Bar graddfa = 100 µm.
Mae darganfod a chymhwyso cynhyrchion naturiol newydd wedi arwain at ddatblygiadau sylweddol mewn amrywiol agweddau ar fywyd dynol, gan gynnwys meddygaeth ac amaethyddiaeth.Mae ymchwil hanesyddol wedi'i wneud i gael cyfansoddion defnyddiol o adnoddau naturiol.Yn benodol, gwyddys bod actinomycetes yn ddefnyddiol fel gwrthfiotigau gwrthbarasitig ar gyfer nematodau oherwydd eu gallu i gynhyrchu metabolion eilaidd amrywiol megis avermectin, cyfansoddyn plwm ivermectin a bleomycin a'i ddeilliadau, a ddefnyddir yn feddyginiaethol fel cyfrwng gwrthganser21,22.Yn yr un modd, mae amrywiaeth o gyfansoddion chwynladdol wedi'u darganfod o actinomysetau, y mae rhai ohonynt eisoes yn cael eu defnyddio'n fasnachol1,23.Felly, ystyrir bod dadansoddi metabolion actinomycete i ynysu cynhyrchion naturiol â gweithgareddau biolegol dymunol yn strategaeth effeithiol.Yn yr astudiaeth hon, fe wnaethom ddarganfod cyfansoddyn newydd, coumamonamide, o S. werraensis a'i syntheseiddio'n llwyddiannus.Mae asid Ursonig yn ganolradd synthetig o urbenamid a'i ddeilliadau.Gall achosi cyrlio gwreiddiau nodweddiadol, arddangos gweithgaredd chwynladdol cymedrol i gryf, a niweidio microtiwbwlau planhigion yn uniongyrchol neu'n anuniongyrchol.Fodd bynnag, gall mecanwaith gweithredu asid urmotonig fod yn wahanol i fecanwaith gweithredu atalyddion microtiwbaidd presennol, gan fod KAND 11 hefyd yn tarfu ar ffilamentau actin ac yn achosi marwolaeth celloedd, gan awgrymu mecanwaith rheoleiddio lle mae asid wrmotonig a'i ddeilliadau yn dylanwadu ar ystod eang o strwythurau cytoskeletal..
Bydd nodweddiad manwl pellach o asid urbenonig yn helpu i ddeall mecanwaith gweithredu asid urbenonig yn well.Yn benodol, y nod nesaf yw gwerthuso gallu asid ursonic i glymu i ficrodiwbwlau llai i benderfynu a yw asid ursonic a'i ddeilliadau yn gweithredu'n uniongyrchol ar ficrotiwbwlau ac yn eu dad-bolimereiddio, neu a yw eu gweithred yn arwain at ansefydlogi microtiwbwl.Yn ogystal, mewn achos lle nad yw microtubules yn darged uniongyrchol, bydd nodi safle gweithredu a thargedau moleciwlaidd asid ursonic ar gelloedd planhigion yn helpu i ddeall ymhellach briodweddau cyfansoddion cysylltiedig a ffyrdd posibl o wella gweithgaredd chwynladdol.Datgelodd ein hassiad bioactifedd allu sytotocsig unigryw asid ursonic ar dyfiant planhigion fel Arabidopsis thaliana, tybaco a llysiau'r afu, tra nad effeithiwyd ar gelloedd E. coli na HeLa.Mae ychydig neu ddim gwenwyndra i gelloedd anifeiliaid yn fantais i ddeilliadau asid ursonic os cânt eu datblygu fel chwynladdwyr i'w defnyddio mewn caeau amaethyddol agored.Yn wir, gan fod microtiwbiau yn strwythurau cyffredin mewn ewcaryotau, mae eu hataliad detholus mewn planhigion yn ofyniad allweddol ar gyfer chwynladdwyr.Er enghraifft, mae propyzamide, asiant depolymerizing microtiwbwl sy'n rhwymo'n uniongyrchol i diwbwlin ac yn atal polymerization, yn cael ei ddefnyddio fel chwynladdwr oherwydd ei wenwyndra isel i gelloedd anifeiliaid24.Mewn cyferbyniad â disopyramid, mae gan benzamidau cysylltiedig wahanol nodweddion targed.Yn ogystal â microtiwbwlau planhigion, mae RH-4032 neu benzoxamide hefyd yn atal microtiwbwlau o gelloedd anifeiliaid neu oomysetau, yn y drefn honno, a defnyddir zalilamide fel ffwngleiddiad oherwydd ei ffytowenwyndra isel25,26,27.Mae'r arth sydd newydd ei ddarganfod a'i ddeilliadau yn arddangos sytowenwyndra detholus yn erbyn planhigion, ond mae'n werth nodi y gallai addasiadau pellach newid eu penodoldeb targed, gan ddarparu deilliadau ychwanegol o bosibl ar gyfer rheoli ffyngau pathogenig neu öomysetau.
Mae priodweddau unigryw asid urbenonig a'i ddeilliadau yn ddefnyddiol ar gyfer eu datblygiad fel chwynladdwyr a'u defnyddio fel offer ymchwil.Mae pwysigrwydd y cytoskeleton wrth reoli siâp celloedd planhigion yn cael ei gydnabod yn eang.Mae astudiaethau cynharach wedi dangos bod planhigion wedi datblygu mecanweithiau cymhleth o drefniadaeth microtiwbwl cortigol trwy reoli dynameg microtiwbwl i reoli morffogenesis yn iawn.Mae nifer fawr o foleciwlau sy'n gyfrifol am reoleiddio gweithgaredd microtiwb wedi'u nodi, ac mae ymchwil cysylltiedig yn dal i fynd rhagddo3,4,28.Nid yw ein dealltwriaeth bresennol o ddeinameg microtiwbwl mewn celloedd planhigion yn esbonio'n llawn fecanweithiau trefniadaeth microtiwbyn cortigol.Er enghraifft, er y gall disopyramide ac oryzalin ddadbolymereiddio microtiwbiau, mae disopyramide yn achosi ystumiad gwreiddiau difrifol tra bod oryzalin yn cael effaith gymharol ysgafn.Ar ben hynny, mae treigladau mewn tiwbyn, sy'n sefydlogi microtubules, hefyd yn achosi dextrorotation yn y gwreiddiau, tra nad yw paclitaxel, sydd hefyd yn sefydlogi deinameg microtiwbwl, yn gwneud hynny.Felly, dylai astudio a nodi targedau moleciwlaidd asid wrsolig roi mewnwelediad newydd i reoleiddio microtiwbwlau cortigol planhigion.Yn yr un modd, bydd cymariaethau yn y dyfodol o gemegau sy'n effeithiol wrth hyrwyddo twf ystumiedig, megis disopyramide, a chemegau llai effeithiol, fel oryzalin neu asid kumamotorig, yn rhoi cliwiau i sut mae twf ystumiedig yn digwydd.
Ar y llaw arall, mae ad-drefniadau sytosgerbydol sy'n gysylltiedig ag amddiffyn yn bosibilrwydd arall i egluro sytowenwyndra asid wrsonig.Weithiau mae heintio pathogen neu gyflwyno elicitor i gelloedd planhigion yn achosi dinistrio'r sytosgerbwd a marwolaeth celloedd dilynol29.Er enghraifft, adroddwyd bod cryptoxanthin sy'n deillio o oomysete yn tarfu ar ficrotiwbiau a ffilamentau actin cyn marwolaeth celloedd tybaco, yn debyg i'r hyn sy'n digwydd gyda thriniaeth KAND30,31.Arweiniodd y tebygrwydd rhwng ymatebion amddiffyn ac ymatebion cellog a achosir gan asid ursonic i ni ddamcaniaethu eu bod yn sbarduno prosesau cellog cyffredin, er bod effaith gyflymach a chryfach o asid wrsonig na cryptoxanthin yn amlwg.Fodd bynnag, mae astudiaethau wedi dangos bod tarfu ar ffilamentau actin yn hyrwyddo marwolaeth celloedd digymell, nad yw amhariad microtiwb bob amser yn cyd-fynd ag ef29.Yn ogystal, mae'n dal i gael ei weld a yw naill ai'r pathogen neu'r elicitor yn achosi tyfiant gwreiddiau ystumiedig, fel y mae deilliadau asid ursonic yn ei wneud.Felly, mae gwybodaeth foleciwlaidd sy'n cysylltu ymatebion amddiffyn a'r sytosgerbwd yn broblem ddeniadol i fynd i'r afael â hi.Trwy fanteisio ar bresenoldeb cyfansoddion pwysau moleciwlaidd isel sy'n gysylltiedig ag asid ursonic, yn ogystal ag ystod o ddeilliadau gyda galluoedd amrywiol, gallant ddarparu cyfleoedd i dargedu mecanweithiau cellog anhysbys.
Gyda'i gilydd, bydd darganfod a chymhwyso cyfansoddion newydd sy'n modiwleiddio deinameg microtiwb yn darparu dulliau pwerus i fynd i'r afael â'r mecanweithiau moleciwlaidd cymhleth sy'n sail i bennu siâp celloedd planhigion.Yn y cyd-destun hwn, mae'n bosibl y bydd yr asid urmotonig cyfansawdd a ddatblygwyd yn ddiweddar, sy'n effeithio ar ffilamentau microdiwbiau a actin ac yn achosi marwolaeth celloedd, yn gyfle i ddehongli'r cysylltiad rhwng rheolaeth microtiwb a'r mecanweithiau eraill hyn.Felly, bydd dadansoddiad cemegol a biolegol gan ddefnyddio asid urbenonig yn ein helpu i ddeall y mecanweithiau rheoleiddio moleciwlaidd sy'n rheoli'r cytoskeleton planhigion.
Brechu S. werraensis MK493-CF1 i mewn i fflasg Erlenmeyer wedi'i drysu 500 ml sy'n cynnwys 110 ml o gyfrwng hadau sy'n cynnwys 2% (w/v) galactos, 2% (w/v) past hanfod, 1% (w/v) Cyfansoddiad bacto .-soyton (Thermo Fisher Scientific, Inc.), 0.5% (w/v) dyfyniad corn (KOGOSTCH Co., Ltd., Japan), 0.2% (w/v) (NH4) 2SO4 a 0.2% CaCO3 mewn dŵr wedi'i ddadïoneiddio.(pH 7.4 cyn sterileiddio).Deorwyd y diwylliannau hadau ar siglwr cylchdro (180 rpm) ar 27 ° C am 2 ddiwrnod.Amaethu cynhyrchu trwy eplesu cyflwr solet.Trosglwyddwyd y diwylliant hadau (7 ml) i fflasg K-1 500 ml yn cynnwys 40 g o gyfrwng cynhyrchu sy'n cynnwys 15 g o haidd wedi'i wasgu (MUSO Co., Ltd., Japan) a 25 g o ddŵr wedi'i ddad-ïoneiddio (pH heb ei addasu cyn sterileiddio).).Cynhaliwyd eplesu ar 30°C yn y tywyllwch am 14 diwrnod.Echdynnwyd y deunydd eplesu gyda 40 ml / potel EtOH a'i allgyrchu (1500 g, 4 ° C, 10 munud).Echdynnwyd y supernatant meithrin (60 ml) gyda chymysgedd o 10% MeOH/EtOAc.Anweddwyd yr haen organig dan bwysau llai i gael gweddillion (59.5 mg), a oedd yn destun HPLC gydag elution graddiant (0-10 munud: 90%) ar golofn cam cefn (SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG120, 5 μm, ID 10 mm × hyd 250 mm) H2O/CH3CN, 10–35 munud: 90% H2O/CH3CN i 70% H2O/CH3CN (graddiant), 35–45 munud: 90% H2O/EtOH, 45–155 munud: 90% H2O /EtOH i 100% EtOH (graddiant (graddiant), 155-200 min: 100% EtOH) ar gyfradd llif o 1.5 ml/munud, coumamonamide (1, 36.0 mg) wedi'i ynysu fel powdr amorffaidd gwyn.
Kumamotoamid(1);1H-NMR (500 MHz, CDCl3) δ 6.93 (t, J = 2.5 Hz, 1H), 6.76 (dd, J = 4.3, 1.8 Hz 1H), 6.05 (t, J = 3.8 Hz, 1H).), 4.08 (s, 3H);13C-NMR (125 MHz, CDCl3) δ 161.1, 121.0, 119.9, 112.2, 105.0, 68.3;ESI-HRMS [M+H]+: [C6H9N2O2]+ gwerth wedi'i gyfrifo: 141.0659, gwerth wedi'i fesur: 141.0663, IR νmax 3451, 3414, 3173, 2938, 1603, 1593, 1537 cm
Cafwyd hadau Columbia (Col-0) o Ganolfan Adnoddau Biolegol Arabidopsis (ABRC) gyda chaniatâd ar gyfer defnydd ymchwil.Cafodd hadau Col-0 eu lluosogi a'u cynnal o dan amodau ein labordy a'u defnyddio fel planhigion Arabidopsis o fath gwyllt.Cafodd hadau Arabidopsis eu sterileiddio ar yr wyneb a'u meithrin mewn cyfrwng Murashige a Skoog hanner cryfder sy'n cynnwys 2% o swcros (Fujifilm Wako Pure Chemical), 0.05% (w/v) 2-(4-morpholino) asid ethanesulfonig (MES) (Fujifilm Wako Pure Chemical). ).) a 1.5% agar (Fujifilm Wako Pur Chemical), pH 5.7, ar 23 ° C a golau cyson.Darparwyd hadau'r mutant phs1-1 gan T. Hashimoto (Sefydliad Gwyddoniaeth a Thechnoleg Nara).
Darparwyd hadau straen SR-1 gan T. Hashimoto (Sefydliad Gwyddoniaeth a Thechnoleg Nara) a'u defnyddio fel planhigion tybaco math gwyllt.Cafodd hadau tybaco eu sterileiddio ar yr wyneb a'u socian mewn dŵr di-haint am dair noson i hyrwyddo egino, yna eu rhoi mewn hydoddiant hanner cryfder yn cynnwys swcros 2%, 0.05% (w/v) MES, a 0.8% gwm gellan (Fujifilm Wako Pure Chemical) Murashige.a chyfrwng Skoog) gyda pH 5.7 a'i ddeor ar 23°C o dan olau cyson.
Darparwyd Strain Tak-1 gan T. Kohchi (Prifysgol Kyoto) ac fe'i defnyddiwyd fel yr uned arbrofol safonol ar gyfer yr astudiaeth o lysiau'r afu.Cafwyd Gemma o blanhigion diwylliedig wedi'u diheintio ac yna'i blatio ar gyfrwng Gamborg B5 (Fujifilm Wako Pure Chemical) yn cynnwys 1% swcros a 0.3% gwm gellan a'i ddeor ar 23 ° C o dan olau parhaus.
Darparwyd celloedd tybaco BY-2 (Nicotiana tabacum L. cv. Bright Yellow 2) gan S. Hasezawa (Prifysgol Tokyo).Gwanhawyd celloedd BY-2 95-plyg mewn cyfrwng Linsmeier a Skoog wedi'u haddasu a'u hategu bob wythnos ag asid 2,4-dichlorophenoxyacetig 32 .Cymysgwyd yr ataliad cell ar siglwr cylchdro ar 130 rpm ar 27 ° C yn y tywyllwch.Golchwch gelloedd 10 gwaith cyfaint y cyfrwng ffres ac ail-ddarparwch yn yr un cyfrwng.Cynhyrchwyd llinellau celloedd trawsgenig BY-2 yn sefydlog sy'n mynegi'r marciwr microtiwbwl TagRFP-TUA6 neu'r marciwr ffilament actin GFP-ABD2 o dan hyrwyddwr firws mosaig blodfresych 35S fel y disgrifiwyd33,34,35.Gellir cynnal a chydamseru'r llinellau cell hyn gan ddefnyddio gweithdrefnau tebyg i'r rhai a ddefnyddiwyd ar gyfer y llinell gell BY-2 wreiddiol.
Cafodd celloedd HeLa eu meithrin yng nghyfrwng addasedig Eagle's (DMEM) (Life Technologies) Dulbecco wedi'i ategu gan serwm buchol ffetws 10%, penisilin 1.2 U/ml, a streptomycin 1.2 μg/ml mewn deorydd 37°C gyda 5% CO2.
Perfformiwyd yr holl arbrofion a ddisgrifir yn y llawysgrif hon yn unol â rheoliadau a chanllawiau bioddiogelwch Japan.
Cafodd cyfansoddion eu toddi mewn dimethyl sulfoxide (DMSO; Fujifilm Wako Pure Chemical) fel datrysiadau stoc a'u gwanhau mewn cyfrwng MS ar gyfer Arabidopsis a thybaco neu gyfrwng Gamborg B5 ar gyfer llysiau'r afu.Ar gyfer y assay atal twf gwreiddiau, hauwyd mwy na 10 hadau fesul plât ar gyfrwng agar yn cynnwys y cyfansoddion a nodir neu DMSO.Deorwyd hadau mewn siambr dyfu am 7 diwrnod.Tynnwyd llun yr eginblanhigion a mesurwyd hyd y gwreiddiau.Ar gyfer assay egino Arabidopsis, hauwyd 48 hadau fesul plât ar gyfrwng agar sy'n cynnwys cyfansawdd 200 μM neu DMSO.Tyfwyd hadau Arabidopsis mewn siambr dwf a chafodd nifer yr eginblanhigion egino ei gyfrif 7 diwrnod ar ôl egino (dag).Ar gyfer assay egino tybaco, hauwyd 24 hadau fesul plât ar gyfrwng agar yn cynnwys 200 μM KAND neu DMSO.Tyfwyd hadau tybaco mewn siambr dwf a chafodd nifer yr eginblanhigion egino ei gyfrif ar ôl 14 diwrnod.Ar gyfer y prawf atal twf llysiau'r afu, cafodd 9 embryon o bob plât eu platio ar gyfrwng agar yn cynnwys y crynodiadau a nodir o KAND neu DMSO a'u deor mewn siambr dyfu am 14 diwrnod.
Defnyddiwch eginblanhigion wedi'u staenio â 5 mg/ml propidium ïodid (PI) i ddelweddu trefniadaeth meristem gwreiddiau.Arsylwyd signalau DP gan ficrosgopeg fflworoleuedd gan ddefnyddio microsgop sganio laser confocal TCS SPE (Leica Microsystems).
Perfformiwyd staenio gwreiddiau histocemegol â β-glucuronidase (GUS) yn unol â'r protocol a ddisgrifiwyd gan Malami a Benfey36.Gosodwyd eginblanhigion mewn 90% aseton dros nos, wedi'u staenio â 0.5 mg/ml 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-d-glucuronic asid mewn byffer GUS am 1 awr a'i roi mewn hydoddiant cloraldehyd hydradol.(8 g hydrad cloral, 2 ml o ddŵr ac 1 ml glyserol) ac a arsylwyd gan ficrosgopeg cyferbyniad ymyrraeth wahaniaethol gan ddefnyddio microsgop Axio Imager M1 (Carl Zeiss).
Mesurwyd onglau gwreiddiau ar eginblanhigion 7 diwrnod oed a dyfwyd ar blatiau wedi'u gosod yn fertigol.Mesurwch ongl y gwreiddyn o gyfeiriad y fector disgyrchiant fel y disgrifir yng ngham 6.
Arsylwyd trefniant y microtiwbwlau cortigol fel y disgrifiwyd, gyda mân addasiadau i'r protocol 37 .Defnyddiwyd gwrthgorff gwrth-β-tiwbwlin (KMX-1, Merk Millipore: MAB3408) ac IgG gwrth-lygoden cyfunedig Alexa Fluor 488 (Thermo Fisher Scientific: A32723) fel gwrthgyrff cynradd ac uwchradd ar wanediadau 1:1000 a 1:100, yn y drefn honno.Cafwyd delweddau fflworoleuedd gan ddefnyddio microsgop sganio laser confocal TCS SPE (Leica Microsystems).Caffael delweddau Z-stack a chreu rhagamcaniadau dwyster mwyaf yn unol â chyfarwyddiadau'r gwneuthurwr.
Perfformiwyd assay amlhau celloedd HeLa gan ddefnyddio Cell Counting Kit 8 (Dojindo) yn unol â chyfarwyddiadau'r gwneuthurwr.
Dadansoddwyd twf E. coli DH5α trwy fesur dwysedd celloedd mewn diwylliant gan ddefnyddio sbectroffotomedr ar 600 nm (OD600).
Gwelwyd trefniadaeth sytosgerbydol mewn celloedd trawsgenig BY-2 gan ddefnyddio microsgop fflworoleuedd wedi'i gyfarparu â dyfais sganio confocal CSU-X1 (Yokogawa) a chamera sCMOS (Zyla, Andor Technology).Aseswyd dwysedd sytosgerbydol trwy ddadansoddi delweddau, a fesurodd ganran y picsel cytosgerbydol ymhlith picseli cytoplasmig mewn delweddau confocal gan ddefnyddio meddalwedd ImageJ fel y disgrifiwyd38,39.
Er mwyn canfod marwolaeth celloedd mewn celloedd BY-2, deorwyd aliquot o ataliad y gell gyda 0.05% Evans glas am 10 munud ar dymheredd ystafell.Mae staen glas dewisol Evans ar gelloedd marw yn dibynnu ar allwthio'r llifyn o gelloedd hyfyw gan y bilen plasma cyfan40.Gwelwyd celloedd lliw gan ddefnyddio microsgop maes llachar (BX53, Olympus).
Tyfwyd celloedd HeLa mewn DMEM ynghyd â 10% FBS mewn deorydd llaith ar 37 ° C a 5% CO2.Cafodd celloedd eu trin â 100 μM KAND 11, asid kumamonamic 6, kumamonamide 1, colcemid 100 ng/ml (Gibco), neu 100 ng/ml Nocodmaze (Sigma) am 6 h ar 37°C.Gosodwyd celloedd gyda MetOH am 10 munud ac yna gydag asetad am 5 munud ar dymheredd ystafell.Cafodd celloedd sefydlog eu deor â gwrthgorff cynradd β-tiwbwlin (1D4A4, Proteintech: 66240-1) wedi'i wanhau mewn 0.5% BSA/PBS am 2 awr, eu golchi 3 gwaith gyda TBST, ac yna eu deor â gwrthgorff gafr Alexa Fluor.488 1 awr.– Llygoden IgG (Thermo Fisher Scientific: A11001) a 15 ng/ml 4′,6-diimidino-2-phenylindole (DAPI) wedi'i wanhau mewn 0.5% BSA/PBS.Ar ôl golchi â TBST deirgwaith, gwelwyd celloedd lliw ar ficrosgop gwrthdro Nikon Eclipse Ti-E.Cafodd delweddau eu dal gyda chamera CCD Hamamatsu ORCA-R2 wedi'i oeri gan ddefnyddio meddalwedd MetaMorph (Dyfeisiau Moleciwlaidd).
Amser postio: Mehefin-17-2024