Mae ffosfforyleiddiad yn actifadu'r prif reoleiddiwr twf DELLA, gan hyrwyddo rhwymiad histone H2A i chromatin mewn Arabidopsis.

Mae proteinau DELLA yn cael eu cadwrheoleiddwyr twfsy'n chwarae rhan ganolog yn natblygiad planhigion mewn ymateb i signalau mewnol ac allanol. Fel rheolyddion trawsgrifio, mae DELLAs yn rhwymo i ffactorau trawsgrifio (TFs) a histone H2A trwy eu parthau GRAS ac yn cael eu recriwtio i weithredu ar hyrwyddwyr. Mae astudiaethau diweddar wedi dangos bod sefydlogrwydd DELLA yn cael ei reoleiddio ôl-gyfieithu gan ddau fecanwaith: polyubiquitination a achosir gan yr hormon planhigiongibberellin, sy'n arwain at eu diraddio cyflym, a chyfuniad ag addasydd bach tebyg i ubiquitin (SUMO), sy'n cynyddu eu croniad. Ar ben hynny, mae gweithgaredd DELLA yn cael ei reoleiddio'n ddeinamig gan ddau fecanwaith glycosylation gwahanol: mae O-fucosylation yn gwella rhyngweithio DELLA-TF, tra bod addasiad N-acetylglucosamine (O-GlcNAc) sy'n gysylltiedig ag O yn atal rhyngweithio DELLA-TF. Fodd bynnag, nid yw rôl ffosfforyleiddiad DELLA yn glir gan fod astudiaethau blaenorol wedi dangos canlyniadau croes, gyda rhai yn awgrymu bod ffosfforyleiddiad yn hyrwyddo neu'n atal diraddio DELLA ac eraill yn awgrymu nad yw ffosfforyleiddiad yn effeithio ar eu sefydlogrwydd. Yma, rydym yn nodi safleoedd ffosfforyleiddiad yn y gwrthwasgydd GA1-3 (RGA), AtDELLA, wedi'i buro o Arabidopsis thaliana trwy sbectrometreg màs ac yn dangos bod ffosfforyleiddiad dau peptid RGA yn y rhanbarthau PolyS a PolyS / T yn gwella gweithgaredd RGA trwy hyrwyddo rhwymo H2A a chysylltiad RGA â hyrwyddwyr targed. Yn nodedig, nid oedd ffosfforyleiddiad yn effeithio ar ryngweithiadau RGA-TF na sefydlogrwydd RGA. Mae ein hastudiaeth yn datgelu mecanwaith moleciwlaidd lle mae ffosfforyleiddiad yn ysgogi gweithgaredd DELLA.
Datgelodd ein dadansoddiad sbectrometrig màs fod Pep1 a Pep2 wedi'u ffosfforyleiddio'n fawr yn RGA yn y cefndir GA1 diffygiol. Yn ogystal â'r astudiaeth hon, mae astudiaethau ffosffoproteomig hefyd wedi datgelu ffosfforyleiddiad Pep1 yn RGA, er nad yw ei rôl wedi'i hastudio53,54,55 eto. Mewn cyferbyniad, nid yw ffosfforyleiddiad Pep2 wedi'i ddisgrifio'n flaenorol gan mai dim ond trwy ddefnyddio'r transgene RGAGKG y gellid canfod y peptid hwn. Er bod y mwtaniad m1A, a ddiddymodd ffosfforyleiddiad Pep1, dim ond ychydig yn lleihau gweithgaredd RGA mewn planta, cafodd effaith ychwanegyn o'i gyfuno â m2A wrth leihau gweithgaredd RGA (Ffigur Atodol 6). Yn bwysig, gostyngwyd ffosfforyleiddiad Pep1 yn sylweddol yn y mutant sly1 gwell GA o'i gymharu â ga1, gan awgrymu bod GA yn hyrwyddo dephosphorylation RGA, gan leihau ei weithgaredd. Mae angen ymchwilio ymhellach i'r mecanwaith y mae GA yn ei ddefnyddio i atal ffosfforyleiddiad RGA. Un posibilrwydd yw bod hyn yn cael ei gyflawni trwy reoleiddio kinase protein anhysbys. Er bod astudiaethau wedi dangos bod mynegiant y protein CK1 kinase EL1 yn cael ei isreoleiddio gan GA mewn reis41, mae ein canlyniadau'n dangos nad yw treigladau lefel uwch o homolog Arabidopsis EL1 (AEL1-4) yn lleihau ffosfforyleiddiad RGA. Mewn cytundeb â’n canlyniadau, ni nododd astudiaeth ffosffoproteomig ddiweddar a ddefnyddiodd linellau gorfynegi Arabidopsis AEL a mutant triphlyg ael unrhyw broteinau DELLA fel swbstradau o’r kinases hyn56. Pan wnaethom baratoi'r llawysgrif, dywedwyd bod GSK3, y genyn sy'n amgodio kinase tebyg i GSK3/SHAGGY mewn gwenith (Triticum aestivum), yn gallu ffosfforyleiddio DELLA (Rht-B1b)57, er nad yw ffosfforyleiddiad Rht-B1b gan GSK3 wedi'i gadarnhau mewn planta. Datgelodd adweithiau ensymatig in vitro ym mhresenoldeb GSK3 a ddilynwyd gan ddadansoddiad sbectrometreg màs dri safle ffosfforyleiddiad wedi'u lleoli rhwng parthau DELLA a GRAS Rht-B1b (Ffig Atodol 3). Arweiniodd amnewidion serine i alanin ym mhob un o’r tri safle ffosfforyleiddiad at lai o weithgaredd Rht-B1b mewn gwenith trawsenynnol, yn gyson â’n canfyddiadau bod amnewidion alanin yn Pep2 RGA wedi lleihau gweithgaredd RGA. Fodd bynnag, dangosodd profion diraddio protein in vitro ymhellach y gall ffosfforyleiddiad hefyd sefydlogi Rht-B1b57. Mae hyn yn wahanol i'n canlyniadau sy'n dangos nad yw amnewidion alanin yn Pep2 RGA yn newid ei sefydlogrwydd mewn planta. Mae GSK3 mewn gwenith yn ortholog o brotein ansensitif brassinosteroid 2 (BIN2) yn Arabidopsis 57. Mae BIN2 yn rheoleiddiwr negyddol o signalau BR, ac mae BR yn actifadu ei lwybr signalau trwy achosi diraddio BIN2 58. Rydym yn dangos nad yw triniaeth BR yn lleihau sefydlogrwydd RGA 59 na lefelau ffosfforyleiddiad yn Arabidopsis (Ffigurau 2) yn awgrymu bod RGA yn annhebygol ffosfforyleiddio gan BIN2.
Dadansoddwyd yr holl ddata meintiol yn ystadegol gan ddefnyddio Excel, a darganfuwyd gwahaniaethau sylweddol gan ddefnyddio prawf-t Student. Ni ddefnyddiwyd unrhyw ddulliau ystadegol i rag-bennu maint y sampl. Ni chafodd unrhyw ddata ei eithrio o'r dadansoddiad; ni chafodd yr arbrawf ei wneud ar hap; ac roedd yr ymchwilwyr yn ymwybodol o'r dyraniad yn ystod yr arbrawf a'r asesiad canlyniad. Darperir meintiau sampl yn y chwedlau ffigur ac yn y ffeiliau data crai.