Mae proteinau DELLA wedi'u cadwrheoleiddwyr twfsy'n chwarae rhan ganolog yn natblygiad planhigion mewn ymateb i signalau mewnol ac allanol. Fel rheoleiddwyr trawsgrifio, mae DELLAs yn rhwymo i ffactorau trawsgrifio (TFs) a histon H2A trwy eu parthau GRAS ac yn cael eu recriwtio i weithredu ar hyrwyddwyr. Mae astudiaethau diweddar wedi dangos bod sefydlogrwydd DELLA yn cael ei reoleiddio ar ôl cyfieithu gan ddau fecanwaith: polyubiquitineiddio a achosir gan yr hormon planhigiongibberellin, sy'n arwain at eu diraddio cyflym, a'u cysylltu â haddasydd bach tebyg i iwbigwitin (SUMO), sy'n cynyddu eu croniad. Ar ben hynny, mae gweithgaredd DELLA yn cael ei reoleiddio'n ddeinamig gan ddau fecanwaith glycosyleiddio gwahanol: mae O-ffwcosyleiddio yn gwella rhyngweithio DELLA-TF, tra bod addasu N-asetylglwcosamin sy'n gysylltiedig ag O (O-GlcNAc) yn atal rhyngweithio DELLA-TF. Fodd bynnag, nid yw rôl ffosfforyleiddio DELLA yn glir gan fod astudiaethau blaenorol wedi dangos canlyniadau gwrthgyferbyniol, gyda rhai'n awgrymu bod ffosfforyleiddio yn hyrwyddo neu'n atal diraddio DELLA ac eraill yn awgrymu nad yw ffosfforyleiddio yn effeithio ar eu sefydlogrwydd. Yma, rydym yn nodi safleoedd ffosfforyleiddio yn yr atalydd GA1-3 (RGA), AtDELLA, wedi'i buro o Arabidopsis thaliana trwy sbectrometreg màs ac yn dangos bod ffosfforyleiddio dau peptid RGA yn rhanbarthau PolyS a PolyS/T yn gwella gweithgaredd RGA trwy hyrwyddo rhwymo H2A a chysylltiad RGA â hyrwyddwyr targed. Yn nodedig, ni effeithiodd ffosfforyleiddio ar ryngweithiadau RGA-TF na sefydlogrwydd RGA. Mae ein hastudiaeth yn datgelu mecanwaith moleciwlaidd lle mae ffosfforyleiddiad yn ysgogi gweithgaredd DELLA.
Datgelodd ein dadansoddiad sbectrometreg màs fod Pep1 a Pep2 ill dau wedi'u ffosfforyleiddio'n fawr yn RGA yn y cefndir Ga1 diffygiol o ran GA. Yn ogystal â'r astudiaeth hon, mae astudiaethau ffosffoproteomig hefyd wedi datgelu ffosfforyleiddiad Pep1 yn RGA, er nad yw ei rôl wedi'i hastudio eto53,54,55. Mewn cyferbyniad, nid yw ffosfforyleiddiad Pep2 wedi'i ddisgrifio o'r blaen gan mai dim ond gan ddefnyddio'r trawsgen RGAGKG y gellid canfod y peptid hwn. Er mai dim ond ychydig o leihau gweithgaredd RGA mewn planta a wnaeth y mwtaniad m1A, a ddiddymodd ffosfforyleiddiad Pep1, gael effaith ychwanegol pan gafodd ei gyfuno ag m2A wrth leihau gweithgaredd RGA (Ffigur Atodol 6). Yn bwysig, gostyngwyd ffosfforyleiddiad Pep1 yn sylweddol yn y mutant sly1 wedi'i wella gan GA o'i gymharu â ga1, gan awgrymu bod GA yn hyrwyddo dadffosfforyleiddiad RGA, gan leihau ei weithgaredd. Mae angen ymchwilio ymhellach i'r mecanwaith y mae GA yn atal ffosfforyleiddiad RGA drwyddo. Un posibilrwydd yw bod hyn yn cael ei gyflawni trwy reoleiddio protein kinase anhysbys. Er bod astudiaethau wedi dangos bod mynegiant y protein kinase CK1 EL1 yn cael ei ostwng gan GA mewn reis41, mae ein canlyniadau'n dangos nad yw mwtaniadau uwch-drefn homolog Arabidopsis EL1 (AEL1-4) yn lleihau ffosfforyleiddiad RGA. Yn unol â'n canlyniadau, ni wnaeth astudiaeth ffosffoproteomig ddiweddar gan ddefnyddio llinellau gor-fynegi Arabidopsis AEL a mutant triphlyg ael nodi unrhyw broteinau DELLA fel swbstradau'r kinasau hyn56. Pan wnaethom baratoi'r llawysgrif, adroddwyd y gall GSK3, y genyn sy'n amgodio kinase tebyg i GSK3/SHAGGY mewn gwenith (Triticum aestivum), ffosfforyleiddio DELLA (Rht-B1b)57, er nad yw ffosfforyleiddiad Rht-B1b gan GSK3 wedi'i gadarnhau in planta. Datgelodd adweithiau ensymatig in vitro ym mhresenoldeb GSK3 ac yna dadansoddiad sbectrometreg màs dair safle ffosfforyleiddiad wedi'u lleoli rhwng parthau DELLA a GRAS Rht-B1b (Ffig. Atodol 3). Arweiniodd amnewidiadau serin i alanin ym mhob un o'r tri safle ffosfforyleiddiad at ostyngiad yng ngweithgaredd Rht-B1b mewn gwenith trawsgenig, yn gyson â'n canfyddiadau bod amnewidiadau alanin yn Pep2 RGA wedi lleihau gweithgaredd RGA. Fodd bynnag, dangosodd asesiadau diraddio protein in vitro ymhellach y gall ffosfforyleiddiad hefyd sefydlogi Rht-B1b57. Mae hyn yn groes i'n canlyniadau sy'n dangos nad yw amnewidiadau alanin yn Pep2 RGA yn newid ei sefydlogrwydd mewn planta. Mae GSK3 mewn gwenith yn ortholog o brotein 2 sy'n ansensitif i brassinosteroid (BIN2) yn Arabidopsis 57. Mae BIN2 yn rheolydd negyddol o signalau BR, ac mae BR yn actifadu ei lwybr signalau trwy achosi diraddio BIN2 58. Dangoson ni nad yw triniaeth BR yn lleihau sefydlogrwydd RGA 59 na lefelau ffosfforyleiddiad yn Arabidopsis (Ffigur Atodol 2), gan awgrymu nad yw'n debygol y bydd RGA yn cael ei ffosfforyleiddio gan BIN2.
Dadansoddwyd yr holl ddata meintiol yn ystadegol gan ddefnyddio Excel, a phennwyd gwahaniaethau arwyddocaol gan ddefnyddio prawf-t Myfyrwyr. Ni ddefnyddiwyd unrhyw ddulliau ystadegol i ragbennu maint y sampl. Ni chafodd unrhyw ddata ei eithrio o'r dadansoddiad; ni chafodd yr arbrawf ei roi ar hap; ac roedd yr ymchwilwyr yn ymwybodol o'r dyraniad yn ystod yr arbrawf a'r asesiad canlyniad. Darperir meintiau'r samplau yn y chwedlau ffigurau ac yn y ffeiliau data crai.
Amser postio: 15 Ebrill 2025