Mae twf meristem apigol blagur (SAM) yn hanfodol ar gyfer pensaernïaeth coesyn. Hormonau planhigiongibberellinauMae (GAs) yn chwarae rolau allweddol wrth gydlynu twf planhigion, ond mae eu rôl yn y SAM yn parhau i fod heb ei ddeall yn dda. Yma, fe wnaethom ddatblygu biosynhwyrydd ratiometrig o signalau GA trwy beiriannu'r protein DELLA i atal ei swyddogaeth reoleiddio hanfodol yn yr ymateb trawsgrifiadol GA tra'n cadw ei ddiraddiad ar ôl adnabod GA. Rydym yn dangos bod y biosynhwyrydd hwn sy'n seiliedig ar ddiraddiad yn cofnodi newidiadau mewn lefelau GA a synhwyro cellog yn gywir yn ystod datblygiad. Defnyddiwyd y biosynhwyrydd hwn i fapio gweithgaredd signalau GA yn y SAM. Rydym yn dangos bod signalau GA uchel yn bresennol yn bennaf mewn celloedd sydd wedi'u lleoli rhwng primordia organau, sy'n rhagflaenwyr i gelloedd internod. Gan ddefnyddio dulliau ennill- a cholli-swyddogaeth, rydym yn dangos ymhellach fod GA yn rheoleiddio cyfeiriadedd y plân rhannu celloedd, gan sefydlu'r trefniadaeth gellog ganonaidd o internodau, a thrwy hynny hyrwyddo manyleb internod yn y SAM.
Mae meristem apigol yr egin (SAM), sydd wedi'i leoli ar big yr egin, yn cynnwys cilfach o gelloedd bonyn y mae eu gweithgaredd yn cynhyrchu organau ochrol a nodau coesyn mewn modd modiwlaidd ac ailadroddus drwy gydol oes y planhigyn. Mae pob un o'r unedau ailadroddus hyn, neu nodau planhigion, yn cynnwys internodau ac organau ochrol yn y nodau, a meristemau ceseiliog yng nghefeiliau'r dail1. Mae twf a threfniadaeth nodau planhigion yn newid yn ystod datblygiad. Yn Arabidopsis, mae twf internodau yn cael ei atal yn ystod y cyfnod llystyfol, ac mae meristemau ceseiliog yn aros yn segur yng nghefeiliau dail rhoséd. Yn ystod y newid i'r cyfnod blodeuog, mae'r SAM yn dod yn feristem y fflwr, gan gynhyrchu internodau hirgul a blagur ceseiliog, canghennau bach yng nghefeiliau dail blodeuog, ac yn ddiweddarach, blodau di-ddail2. Er ein bod wedi gwneud cynnydd sylweddol o ran deall y mecanweithiau sy'n rheoli cychwyn dail, blodau a changhennau, ychydig iawn a wyddys am sut mae internodau'n codi.
Bydd deall dosbarthiad gofod-amserol GAs yn helpu i ddeall swyddogaethau'r hormonau hyn yn well mewn gwahanol feinweoedd ac ar wahanol gamau datblygiadol. Mae delweddu dirywiad y cyfuniad RGA-GFP a fynegir o dan weithred ei hyrwyddwr ei hun yn darparu gwybodaeth bwysig am reoleiddio cyfanswm lefelau GA mewn gwreiddiau15,16. Fodd bynnag, mae mynegiant RGA yn amrywio ar draws meinweoedd17 ac yn cael ei reoleiddio gan GA18. Felly, gall mynegiant gwahaniaethol yr hyrwyddwr RGA arwain at y patrwm fflwroleuol a welwyd gydag RGA-GFP ac felly nid yw'r dull hwn yn feintiol. Yn fwy diweddar, datgelodd GA wedi'i labelu â fflwroleuedd (Fl) bioactif19,20 gronni GA yn endocortex y gwreiddyn a rheoleiddio ei lefelau cellog gan gludiant GA. Yn ddiweddar, dangosodd y synhwyrydd GA FRET nlsGPS1 fod lefelau GA yn cydberthyn ag ymestyn celloedd mewn gwreiddiau, ffilamentau, a hypocotylau tyfiant tywyll21. Fodd bynnag, fel y gwelsom, nid crynodiad GA yw'r unig baramedr sy'n rheoli gweithgaredd signalau GA, gan ei fod yn dibynnu ar brosesau synhwyro cymhleth. Yma, gan adeiladu ar ein dealltwriaeth o lwybrau signalau DELLA a GA, rydym yn adrodd ar ddatblygiad a nodweddiad biosynhwyrydd ratiometrig sy'n seiliedig ar ddiraddio ar gyfer signalau GA. I ddatblygu'r biosynhwyrydd meintiol hwn, fe wnaethom ddefnyddio RGA sensitif i GA mwtant a gafodd ei asio â phrotein fflwroleuol a'i fynegi'n gyffredin mewn meinweoedd, yn ogystal â phrotein fflwroleuol nad yw'n sensitif i GA. Rydym yn dangos nad yw'r asiadau protein RGA mwtant yn ymyrryd â signalau GA endogenaidd pan gânt eu mynegi'n gyffredin, a bod y biosynhwyrydd hwn yn gallu mesur gweithgaredd signalau sy'n deillio o fewnbwn GA a phrosesu signal GA gan y cyfarpar synhwyro gyda datrysiad gofod-amserol uchel. Fe wnaethom ddefnyddio'r biosynhwyrydd hwn i fapio dosbarthiad gofod-amserol gweithgaredd signalau GA a mesur sut mae GA yn rheoleiddio ymddygiad cellog yn epidermis SAM. Rydym yn dangos bod GA yn rheoleiddio cyfeiriadedd plân rhannu celloedd SAM sydd wedi'u lleoli rhwng primordia organau, a thrwy hynny ddiffinio trefniadaeth cellog canonaidd yr internod.
Yn olaf, gofynnwyd a allai qmRGA adrodd am newidiadau mewn lefelau GA mewndarddol gan ddefnyddio hypocotylau sy'n tyfu. Dangoswyd gennym yn flaenorol fod nitrad yn ysgogi twf trwy gynyddu synthesis GA ac, yn ei dro, diraddio DELLA34. Yn unol â hynny, gwelsom fod hyd yr hypocotyl mewn eginblanhigion pUBQ10::qmRGA a dyfwyd o dan gyflenwad nitrad toreithiog (10 mM NO3−) yn sylweddol hirach nag mewn eginblanhigion a dyfwyd o dan amodau diffygiol o nitrad (Ffig. Atodol 6a). Yn gyson â'r ymateb twf, roedd signalau GA yn uwch mewn hypocotylau eginblanhigion a dyfwyd o dan amodau 10 mM NO3− nag mewn eginblanhigion a dyfwyd yn absenoldeb nitrad (Ffig. Atodol 6b, c). Felly, mae qmRGA hefyd yn galluogi monitro newidiadau mewn signalau GA a achosir gan newidiadau mewndarddol yng nghrynodiad GA.
Er mwyn deall a yw'r gweithgaredd signalau GA a ganfyddir gan qmRGA yn dibynnu ar grynodiad GA a chanfyddiad GA, fel y disgwylir yn seiliedig ar ddyluniad y synhwyrydd, dadansoddom fynegiant y tri derbynnydd GID1 mewn meinweoedd llystyfol ac atgenhedlu. Mewn eginblanhigion, dangosodd y llinell adroddwr GID1-GUS fod GID1a a c wedi'u mynegi'n uchel mewn cotyledons (Ffig. 3a–c). Yn ogystal, mynegwyd y tri derbynnydd mewn dail, primordia gwreiddiau ochrol, blaenau gwreiddiau (ac eithrio cap gwreiddyn GID1b), a'r system fasgwlaidd (Ffig. 3a–c). Yn SAM y blodeuogrwydd, dim ond ar gyfer GID1b ac 1c y canfuom signalau GUS (Ffig. Atodol 7a–c). Cadarnhaodd hybridio in situ y patrymau mynegiant hyn a dangosodd ymhellach fod GID1c wedi'i fynegi'n unffurf ar lefelau isel yn yr SAM, tra bod GID1b yn dangos mynegiant uwch ar gyrion yr SAM (Ffig. Atodol 7d–l). Datgelodd y cyfuniad cyfieithiadol pGID1b::2xmTQ2-GID1b hefyd ystod raddol o fynegiant GID1b, o fynegiant isel neu ddim yng nghanol y SAM i fynegiant uchel ar ffiniau'r organau (Ffig. Atodol 7m). Felly, nid yw derbynyddion GID1 wedi'u dosbarthu'n unffurf ar draws ac o fewn meinweoedd. Mewn arbrofion dilynol, gwelsom hefyd fod gorfynegiant GID1 (pUBQ10::GID1a-mCherry) wedi cynyddu sensitifrwydd qmRGA mewn hypocotylau i gymhwysiad GA allanol (Ffig. 3d, e). Mewn cyferbyniad, roedd fflwroleuedd a fesurwyd gan qd17mRGA yn yr hypocotyl yn ansensitif i driniaeth GA3 (Ffig. 3f, g). Ar gyfer y ddau brawf, cafodd eginblanhigion eu trin â chrynodiadau uchel o GA (100 μM GA3) i asesu ymddygiad cyflym y synhwyrydd, lle cafodd y gallu i rwymo i'r derbynnydd GID1 ei wella neu ei golli. Gyda'i gilydd, mae'r canlyniadau hyn yn cadarnhau bod y biosynhwyrydd qmRGA yn cyflawni swyddogaeth gyfunol fel synhwyrydd GA a GA, ac yn awgrymu y gall mynegiant gwahaniaethol y derbynnydd GID1 addasu allyrredd y synhwyrydd yn sylweddol.
Hyd yn hyn, mae dosbarthiad signalau GA yn y SAM yn parhau i fod yn aneglur. Felly, fe wnaethom ddefnyddio planhigion sy'n mynegi qmRGA a'r gohebydd celloedd bonyn pCLV3::mCherry-NLS35 i gyfrifo mapiau meintiol cydraniad uchel o weithgaredd signalau GA, gan ganolbwyntio ar yr haen L1 (epidermis; Ffig. 4a, b, gweler Dulliau a Dulliau Atodol), gan fod L1 yn chwarae rhan allweddol wrth reoli twf SAM36. Yma, darparodd mynegiant pCLV3::mCherry-NLS bwynt cyfeirio geometrig sefydlog ar gyfer dadansoddi dosbarthiad gofod-amserol gweithgaredd signalau GA37. Er bod GA yn cael ei ystyried yn hanfodol ar gyfer datblygiad organau ochrol4, gwelsom fod signalau GA yn isel yn y primordiwm blodau (P) gan ddechrau o gam P3 (Ffig. 4a, b), tra bod gan brimordiwmau ifanc P1 a P2 weithgaredd cymedrol tebyg i'r un yn y rhanbarth canolog (Ffig. 4a, b). Canfuwyd gweithgaredd signalau GA uwch ar ffiniau primordiwm yr organ, gan ddechrau yn P1/P2 (ar ochrau'r ffin) a chyrraedd uchafbwynt yn P4, yn ogystal ag ym mhob cell yn y rhanbarth ymylol a leolir rhwng y primordia (Ffig. 4a, b a Ffig. Atodol 8a, b). Gwelwyd y gweithgaredd signalau GA uwch hwn nid yn unig yn yr epidermis ond hefyd yn yr haenau L2 ac L3 uchaf (Ffig. Atodol 8b). Arhosodd patrwm y signalau GA a ganfuwyd yn y SAM gan ddefnyddio qmRGA heb ei newid dros amser hefyd (Ffig. Atodol 8c–f, k). Er bod y lluniad qd17mRGA wedi'i lawr-reoleiddio'n systematig yn SAM planhigion T3 o bum llinell annibynnol a nodweddwyd gennym yn fanwl, roeddem yn gallu dadansoddi'r patrymau fflwroleuedd a gafwyd gyda'r lluniad pRPS5a::VENUS-2A-TagBFP (Ffig. Atodol 8g–j, l). Yn y llinell reoli hon, dim ond newidiadau bach yn y gymhareb fflwroleuedd a ganfuwyd yn y SAM, ond yng nghanolfan y SAM gwelsom ostyngiad clir ac annisgwyl yn VENUS sy'n gysylltiedig â TagBFP. Mae hyn yn cadarnhau bod y patrwm signalau a welwyd gan qmRGA yn adlewyrchu dirywiad mRGA-VENUS sy'n ddibynnol ar GA, ond mae hefyd yn dangos y gallai qmRGA oramcangyfrif gweithgaredd signalau GA yng nghanol y meristem. I grynhoi, mae ein canlyniadau'n datgelu patrwm signalau GA sy'n adlewyrchu dosbarthiad y primordia yn bennaf. Mae'r dosbarthiad hwn o'r rhanbarth rhyng-gyntefig (IPR) oherwydd sefydlu graddol gweithgaredd signalau GA uchel rhwng y primordiwm sy'n datblygu a'r rhanbarth canolog, tra ar yr un pryd mae gweithgaredd signalau GA yn y primordiwm yn lleihau (Ffig. 4c, d).
Mae dosbarthiad derbynyddion GID1b a GID1c (gweler uchod) yn awgrymu bod mynegiant gwahaniaethol derbynyddion GA yn helpu i lunio patrwm gweithgaredd signalau GA yn y SAM. Roeddem yn meddwl tybed a allai cronni gwahaniaethol o GA fod yn gysylltiedig. I ymchwilio i'r posibilrwydd hwn, fe wnaethom ddefnyddio'r synhwyrydd nlsGPS1 GA FRET21. Canfuwyd amlder actifadu cynyddol yn SAM nlsGPS1 a gafodd ei drin â 10 μM GA4+7 am 100 munud (Ffig. Atodol 9a–e), sy'n dangos bod nlsGPS1 yn ymateb i newidiadau yng nghrynodiad GA yn y SAM, fel y mae mewn gwreiddiau21. Datgelodd dosbarthiad gofodol amlder actifadu nlsGPS1 lefelau GA cymharol isel yn haenau allanol y SAM, ond dangosodd eu bod wedi'u codi yn y canol ac ar ymylon y SAM (Ffig. 4e a Ffig. Atodol 9a,c). Mae hyn yn awgrymu bod GA hefyd wedi'i ddosbarthu yn y SAM gyda phatrwm gofodol tebyg i'r hyn a ddatgelir gan qmRGA. Fel dull cyflenwol, fe wnaethom hefyd drin y SAM gyda GA fflwroleuol (GA3-, GA4-, GA7-Fl) neu Fl yn unig fel rheolaeth negyddol. Dosbarthwyd y signal Fl ledled y SAM, gan gynnwys y rhanbarth canolog a'r primordiwm, er ar ddwyster is (Ffig. 4j a Ffig. Atodol 10d). Mewn cyferbyniad, cronnodd y tri GA-Fl yn benodol o fewn ffiniau'r primordiwm ac i raddau amrywiol yng ngweddill yr IPR, gyda GA7-Fl yn cronni yn y parth mwyaf yn yr IPR (Ffig. 4k a Ffig. Atodol 10a,b). Datgelodd meintioli dwyster fflwroleuol fod y gymhareb dwyster IPR i rai nad ydynt yn IPR yn uwch mewn SAM wedi'i drin â GA-Fl o'i gymharu â SAM wedi'i drin â Fl (Ffig. 4l a Ffig. Atodol 10c). Gyda'i gilydd, mae'r canlyniadau hyn yn awgrymu bod GA yn bresennol mewn crynodiadau uwch mewn celloedd IPR sydd wedi'u lleoli agosaf at ffin yr organ. Mae hyn yn awgrymu bod patrwm gweithgaredd signalau GA SAM yn deillio o fynegiant gwahaniaethol derbynyddion GA a chroniad gwahaniaethol o GA mewn celloedd IPR ger ffiniau organau. Felly, datgelodd ein dadansoddiad batrwm gofod-amserol annisgwyl o signalau GA, gyda gweithgaredd is yng nghanol a phrimordiwm yr SAM a gweithgaredd uwch yn yr IPR yn y rhanbarth ymylol.
Er mwyn deall rôl gweithgaredd signalau GA gwahaniaethol yn y SAM, fe wnaethom ddadansoddi'r gydberthynas rhwng gweithgaredd signalau GA, ehangu celloedd, a rhannu celloedd gan ddefnyddio delweddu amser-dros-amser amser real o'r SAM qmRGA pCLV3::mCherry-NLS. O ystyried rôl GA mewn rheoleiddio twf, roedd disgwyl cydberthynas gadarnhaol â pharamedrau ehangu celloedd. Felly, fe wnaethom gymharu mapiau gweithgaredd signalau GA yn gyntaf â mapiau o gyfradd twf arwyneb celloedd (fel dirprwy ar gyfer cryfder ehangu celloedd ar gyfer cell benodol ac ar gyfer celloedd merch wrth rannu) a chyda mapiau o anisotropi twf, sy'n mesur cyfeiriadedd ehangu celloedd (a ddefnyddir yma hefyd ar gyfer cell benodol ac ar gyfer celloedd merch wrth rannu; Ffig. 5a,b, gweler Dulliau a Dulliau Atodol). Mae ein mapiau o gyfradd twf arwyneb celloedd SAM yn gyson ag arsylwadau blaenorol38,39, gyda chyfraddau twf lleiaf ar y ffin a chyfraddau twf mwyaf mewn blodau sy'n datblygu (Ffig. 5a). Dangosodd dadansoddiad cydrannau pennaf (PCA) fod gweithgaredd signalau GA wedi'i gydberthyn yn negyddol â dwyster twf arwyneb celloedd (Ffigur 5c). Dangoson ni hefyd fod y prif echelinau amrywiad, gan gynnwys mewnbwn signalau GA a dwyster twf, yn orthogonal i'r cyfeiriad a bennwyd gan fynegiant CLV3 uchel, gan gadarnhau bod celloedd wedi'u heithrio o ganolfan SAM yn y dadansoddiadau sy'n weddill. Cadarnhaodd dadansoddiad cydberthynas Spearman ganlyniadau'r PCA (Ffigur 5d), gan nodi nad oedd signalau GA uwch yn yr IPR yn arwain at ehangu celloedd uwch. Fodd bynnag, datgelodd dadansoddiad cydberthynas gydberthynas gadarnhaol fach rhwng gweithgaredd signalau GA ac anisotropi twf (Ffigur 5c, d), gan awgrymu bod signalau GA uwch yn yr IPR yn dylanwadu ar gyfeiriad twf celloedd ac o bosibl safle'r plân rhannu celloedd.
a, b Mapiau gwres o dwf arwyneb cymedrig (a) ac anisotropi twf (b) mewn SAM wedi'u cyfartaleddu dros saith planhigyn annibynnol (a ddefnyddir fel dirprwyon ar gyfer cryfder a chyfeiriad ehangu celloedd, yn y drefn honno). c Roedd dadansoddiad PCA yn cynnwys y newidynnau canlynol: signal GA, dwyster twf arwyneb, anisotropi twf arwyneb, a mynegiant CLV3. Roedd cydran 1 PCA yn bennaf yn gysylltiedig yn negyddol â dwyster twf arwyneb ac yn gysylltiedig yn gadarnhaol â signal GA. Roedd cydran 2 PCA yn bennaf yn gysylltiedig yn gadarnhaol ag anisotropi twf arwyneb ac yn gysylltiedig yn negyddol â mynegiant CLV3. Mae canrannau'n cynrychioli'r amrywiad a eglurir gan bob cydran. d Dadansoddiad cydberthynas Spearman rhwng signal GA, dwyster twf arwyneb, ac anisotropi twf arwyneb ar raddfa'r meinwe ac eithrio CZ. Y rhif ar y dde yw'r gwerth rho Spearman rhwng dau newidyn. Mae seren yn nodi achosion lle mae'r gydberthynas/gydberthynas negyddol yn arwyddocaol iawn. e Delweddu 3D o gelloedd Col-0 SAM L1 trwy ficrosgopeg gonffocal. Mae waliau celloedd newydd a ffurfiwyd yn y SAM (ond nid y primordiwm) ar ôl 10 awr wedi'u lliwio yn ôl eu gwerthoedd ongl. Dangosir y bar lliw yn y gornel dde isaf. Mae'r mewnosodiad yn dangos y ddelwedd 3D gyfatebol ar 0 awr. Ailadroddwyd yr arbrawf ddwywaith gyda chanlyniadau tebyg. f Mae plotiau blwch yn dangos cyfraddau rhannu celloedd mewn SAM IPR a SAM nad yw'n IPR Col-0 (n = 10 planhigyn annibynnol). Mae'r llinell ganol yn dangos y canolrif, ac mae ffiniau'r blwch yn nodi'r 25ain a'r 75ain ganradd. Mae blew'r mwstas yn nodi'r gwerthoedd lleiaf ac uchaf a bennwyd gyda meddalwedd R. Cafwyd gwerthoedd P gyda phrawf-t dwy gynffon Welch. g, h Diagram sgematig yn dangos (g) sut i fesur ongl y wal gell newydd (magenta) mewn perthynas â'r cyfeiriad rheiddiol o ganol y SAM (llinell ddotiog wen) (dim ond gwerthoedd ongl lem, h.y., 0–90°, sy'n cael eu hystyried), a (h) y cyfeiriadau cylcheddol/ochrol a rheiddiol o fewn y meristem. i Histogramau amledd cyfeiriadedd plân rhannu celloedd ar draws y SAM (glas tywyll), IPR (glas canolig), a heb fod yn IPR (glas golau), yn y drefn honno. Cafwyd gwerthoedd P drwy brawf Kolmogorov-Smirnov dwy-gynffon. Ailadroddwyd yr arbrawf ddwywaith gyda chanlyniadau tebyg. j Histogramau amledd cyfeiriadedd plân rhannu celloedd yr IPR o amgylch P3 (gwyrdd golau), P4 (gwyrdd canolig), a P5 (gwyrdd tywyll), yn y drefn honno. Cafwyd gwerthoedd P drwy brawf Kolmogorov-Smirnov dwy-gynffon. Ailadroddwyd yr arbrawf ddwywaith gyda chanlyniadau tebyg.
Felly, fe wnaethom ymchwilio nesaf i'r gydberthynas rhwng signalau GA a gweithgaredd rhannu celloedd trwy nodi waliau celloedd newydd eu ffurfio yn ystod yr assay (Ffig. 5e). Roedd y dull hwn yn caniatáu inni fesur amlder a chyfeiriad rhannu celloedd. Yn syndod, gwelsom fod amlder rhaniadau celloedd yn yr IPR a gweddill y SAM (di-IPR, Ffig. 5f) yn debyg, gan ddangos nad yw gwahaniaethau mewn signalau GA rhwng celloedd IPR a rhai nad ydynt yn IPR yn effeithio'n sylweddol ar rannu celloedd. Fe wnaeth hyn, a'r gydberthynas gadarnhaol rhwng signalau GA ac anisotropi twf, ein hannog i ystyried a allai gweithgaredd signalau GA ddylanwadu ar gyfeiriadedd plân rhannu celloedd. Fe wnaethom fesur cyfeiriadedd wal y gell newydd fel ongl lem o'i gymharu â'r echelin radial sy'n cysylltu canol y meristem a chanol wal y gell newydd (Ffig. 5e-i) a gweld tuedd glir i gelloedd rannu ar onglau yn agos at 90° o'i gymharu â'r echelin radial, gyda'r amleddau uchaf yn cael eu harsylwi ar 70–80° (23.28%) ac 80–90° (22.62%) (Ffig. 5e,i), sy'n cyfateb i raniadau celloedd yn y cyfeiriad cylcheddol/traws (Ffig. 5h). I archwilio cyfraniad signalau GA i'r ymddygiad rhannu celloedd hwn, fe wnaethom ddadansoddi paramedrau rhannu celloedd yn yr IPR a'r di-IPR ar wahân (Ffig. 5i). Gwelsom fod dosbarthiad ongl rhannu celloedd IPR yn wahanol i'r hyn mewn celloedd nad ydynt yn IPR neu mewn celloedd yn y SAM cyfan, gyda chelloedd IPR yn arddangos cyfran uwch o raniadau celloedd ochrol/cylchol, h.y., 70–80° ac 80–90° (33.86% a 30.71%, yn y drefn honno, cyfrannau cyfatebol) (Ffig. 5i). Felly, datgelodd ein harsylwadau gysylltiad rhwng signalau GA uchel a chyfeiriadedd plân rhannu celloedd yn agos at y cyfeiriad cylcheddol, yn debyg i'r gydberthynas rhwng gweithgaredd signalau GA ac anisotropi twf (Ffig. 5c, d). I sefydlu ymhellach gadwraeth ofodol y cysylltiad hwn, mesurom gyfeiriadedd y plân rhannu mewn celloedd IPR o amgylch y primordiwm gan ddechrau o P3, gan fod y gweithgaredd signalau GA uchaf wedi'i ganfod yn y rhanbarth hwn gan ddechrau o P4 (Ffig. 4). Ni ddangosodd onglau rhannu'r IPR o amgylch P3 a P4 unrhyw wahaniaethau ystadegol arwyddocaol, er bod amlder cynyddol o raniadau celloedd ochrol wedi'i arsylwi yn yr IPR o amgylch P4 (Ffig. 5j). Fodd bynnag, yn y celloedd IPR o amgylch P5, daeth y gwahaniaeth yng nghyfeiriadedd plân rhaniad celloedd yn ystadegol arwyddocaol, gyda chynnydd sydyn yn amlder rhaniadau celloedd traws (Ffig. 5j). Gyda'i gilydd, mae'r canlyniadau hyn yn awgrymu y gall signalau GA reoli cyfeiriadedd rhaniadau celloedd yn yr SAM, sy'n gyson ag adroddiadau blaenorol40,41 y gall signalau GA uchel ysgogi cyfeiriadedd ochrol rhaniadau celloedd yn yr IPR.
Rhagwelir na fydd celloedd yn yr IPR yn cael eu hymgorffori mewn primordia ond yn hytrach mewn internodau2,42,43. Gall cyfeiriadedd traws rhaniadau celloedd yn yr IPR arwain at drefniadaeth nodweddiadol rhesi hydredol cyfochrog o gelloedd epidermaidd mewn internodau. Mae ein harsylwadau a ddisgrifir uchod yn awgrymu bod signalau GA yn debygol o chwarae rhan yn y broses hon trwy reoleiddio cyfeiriad rhaniad celloedd.
Mae colli swyddogaeth nifer o enynnau DELLA yn arwain at ymateb GA cyfansoddol, a gellir defnyddio mutantau della i brofi'r ddamcaniaeth hon44. Yn gyntaf, dadansoddom batrymau mynegiant pum genyn DELLA yn y SAM. Datgelodd uno trawsgrifio'r llinell GUS45 fod GAI, RGA, RGL1, ac RGL2 (i raddau llawer llai) wedi'u mynegi yn y SAM (Ffig. Atodol 11a–d). Dangosodd hybridio in situ ymhellach fod mRNA GAI yn cronni'n benodol mewn primordia a blodau sy'n datblygu (Ffig. Atodol 11e). Canfuwyd mRNA RGL1 ac RGL3 ledled canopi'r SAM ac mewn blodau hŷn, tra bod mRNA RGL2 yn fwy niferus yn rhanbarth y ffin (Ffig. Atodol 11f–h). Cadarnhaodd delweddu confocal o SAM pRGL3::RGL3-GFP y mynegiant a welwyd gan hybridio in situ a dangosodd fod protein RGL3 yn cronni yn rhan ganolog y SAM (Ffig. Atodol 11i). Gan ddefnyddio'r llinell pRGA::GFP-RGA, gwelsom hefyd fod protein RGA yn cronni yn y SAM, ond mae ei helaethrwydd yn lleihau ar y ffin gan ddechrau o P4 (Ffig. Atodol 11j). Yn nodedig, mae patrymau mynegiant RGL3 ac RGA yn gyson â gweithgaredd signalau GA uwch yn yr IPR, fel y'i canfuwyd gan qmRGA (Ffig. 4). Ar ben hynny, mae'r data hyn yn dangos bod pob DELLA yn cael ei fynegi yn y SAM a bod eu mynegiant gyda'i gilydd yn cwmpasu'r SAM cyfan.
Nesaf, fe wnaethom ddadansoddi'r paramedrau rhannu celloedd yn y SAM math gwyllt (Ler, rheolaeth) a'r mutantau pumed (byd-eang) gai-t6 rga-t2 rgl1-1 rgl2-1 rgl3-4 della (Ffig. 6a, b). Yn ddiddorol, gwelsom newid ystadegol arwyddocaol yn nosbarthiad amleddau ongl rhannu celloedd yn y SAM mutant della global o'i gymharu â'r math gwyllt (Ffig. 6c). Roedd y newid hwn yn y mutant della global oherwydd cynnydd yn amlder onglau 80–90° (34.71% vs. 24.55%) ac, i raddau llai, onglau 70–80° (23.78% vs. 20.18%), h.y., yn cyfateb i raniadau celloedd traws (Ffig. 6c). Roedd amlder rhaniadau an-draws (0–60°) hefyd yn is yn y mutant della global (Ffig. 6c). Cynyddwyd amlder rhaniadau celloedd traws yn sylweddol yn SAM y mutant della global (Ffig. 6b). Roedd amlder rhaniadau celloedd traws yn yr IPR hefyd yn uwch yn y mutant della global o'i gymharu â'r math gwyllt (Ffig. 6d). Y tu allan i ranbarth IPR, roedd gan y math gwyllt ddosbarthiad mwy unffurf o onglau rhaniad celloedd, tra bod y mutant della global yn ffafrio rhaniadau tangiadol fel yr IPR (Ffig. 6e). Fe wnaethom hefyd fesur cyfeiriadedd rhaniadau celloedd yn SAM y mutantau pumed ga2 oxidase (ga2ox) (ga2ox1-1, ga2ox2-1, ga2ox3-1, ga2ox4-1, a ga2ox6-2), cefndir mutant GA-anweithredol lle mae GA yn cronni. Yn gyson â'r cynnydd yn lefelau GA, roedd SAM y fflwroleuedd mwtant pumed ga2ox yn fwy na Col-0 (Ffig. Atodol 12a, b), ac o'i gymharu â Col-0, dangosodd y SAM pumed ga2ox ddosbarthiad gwahanol iawn o onglau rhannu celloedd, gyda'r amlder ongl yn cynyddu o 50° i 90°, h.y. unwaith eto'n ffafrio rhaniadau tangiadol (Ffig. Atodol 12a–c). Felly, rydym yn dangos bod actifadu cyfansoddol signalau GA a chronni GA yn achosi rhaniadau celloedd ochrol yn yr IPR a gweddill y SAM.
a, b Delweddu 3D o haen L1 Ler wedi'i staenio â PI (a) a mutant della byd-eang (b) SAM gan ddefnyddio microsgopeg gonffocal. Dangosir waliau celloedd newydd a ffurfiwyd yn y SAM (ond nid y primordiwm) dros gyfnod o 10 awr a'u lliwio yn ôl eu gwerthoedd ongl. Mae'r mewnosodiad yn dangos y SAM ar 0 awr. Mae'r bar lliw wedi'i arddangos yn y gornel dde isaf. Mae'r saeth yn (b) yn pwyntio at enghraifft o ffeiliau celloedd wedi'u halinio yn y mutant della byd-eang. Ailadroddwyd yr arbrawf ddwywaith gyda chanlyniadau tebyg. cymhariaeth ce o ddosbarthiad amlder cyfeiriadau plân rhannu celloedd yn y SAM cyfan (d), IPR (e), a di-IPR (f) rhwng Ler a della byd-eang. Cafwyd gwerthoedd P gan ddefnyddio prawf Kolmogorov-Smirnov dwy-gynffon. f, g Delweddu 3D o ddelweddau conffocal o SAM wedi'i staenio â PI o blanhigion trawsgenig Col-0 (i) a pCUC2::gai-1-VENUS (j). Mae paneli (a, b) yn dangos waliau celloedd newydd (ond nid primordia) a ffurfiwyd yn yr SAM o fewn 10 awr. Ailadroddwyd yr arbrawf ddwywaith gyda chanlyniadau tebyg. h–j Cymhariaeth o ddosbarthiad amlder cyfeiriadau plân rhannu celloedd a leolir yn yr SAM cyfan (h), IPR (i) a di-IPR (j) rhwng planhigion Col-0 a pCUC2::gai-1-VENUS. Cafwyd gwerthoedd P gan ddefnyddio prawf Kolmogorov–Smirnov dwy-gynffon.
Nesaf, profon ni effaith atal signalau GA yn benodol yn yr IPR. I'r perwyl hwn, defnyddiwyd yr hyrwyddwr cwpan cotyledon 2 (CUC2) i yrru mynegiant protein gai-1 negyddol dominyddol wedi'i asio â VENUS (yn y llinell pCUC2::gai-1-VENUS). Yn y SAM math gwyllt, mae'r hyrwyddwr CUC2 yn gyrru mynegiant y rhan fwyaf o IPRs yn y SAM, gan gynnwys celloedd ffiniol, o P4 ymlaen, a gwelwyd mynegiant penodol tebyg mewn planhigion pCUC2::gai-1-VENUS (gweler isod). Nid oedd dosbarthiad onglau rhannu celloedd ar draws SAM neu IPR planhigion pCUC2::gai-1-VENUS yn sylweddol wahanol i ddosbarthiad y math gwyllt, er yn annisgwyl gwelsom fod celloedd heb IPR yn y planhigion hyn yn rhannu ar amlder uwch o 80–90° (Ffig. 6f–j).
Awgrymwyd bod cyfeiriad rhaniad celloedd yn dibynnu ar geometreg y SAM, yn enwedig y straen tynnol a gynhyrchir gan gromlin y meinwe46. Felly, gofynnwyd a oedd siâp y SAM wedi newid yn y planhigion mutant della global a pCUC2::gai-1-VENUS. Fel yr adroddwyd yn flaenorol12, roedd maint y SAM mutant della global yn fwy na maint y math gwyllt (Ffig. Atodol 13a, b, d). Cadarnhaodd hybridio in situ o RNA CLV3 ac STM ehangu'r meristem mewn mutantau della a dangosodd ymhellach ehangu ochrol cilfach y gell bonyn (Ffig. Atodol 13e, f, h, i). Fodd bynnag, roedd crymlin y SAM yn debyg yn y ddau genoteip (Ffig. Atodol 13k, m, n, p). Gwelsom gynnydd tebyg o ran maint yn y mutant pedwarplyg gai-t6 rga-t2 rgl1-1 rgl2-1 della heb newid mewn crymlin o'i gymharu â'r math gwyllt (Ffig. Atodol 13c, d, g, j, l, o, p). Effeithiwyd ar amlder cyfeiriadedd rhannu celloedd hefyd yn y mutant pedwarplyg della, ond i raddau llai nag yn y mutant monolithig della (Ffig. Atodol 12d–f). Mae'r effaith dos hon, ynghyd â'r diffyg effaith ar gromlin, yn awgrymu bod gweithgaredd gweddilliol RGL3 yn y mutant pedwarplyg Della yn cyfyngu ar newidiadau mewn cyfeiriadedd rhannu celloedd a achosir gan golli gweithgaredd DELLA a bod newidiadau mewn rhaniadau celloedd ochrol yn digwydd mewn ymateb i newidiadau yng ngweithgaredd signalau GA yn hytrach na newidiadau mewn geometreg SAM. Fel y disgrifiwyd uchod, mae'r hyrwyddwr CUC2 yn gyrru mynegiant IPR yn y SAM gan ddechrau yn P4 (Ffig. Atodol 14a, b), ac mewn cyferbyniad, roedd gan y SAM pCUC2::gai-1-VENUS faint llai ond crymlin uwch (Ffig. Atodol 14c–h). Gall y newid hwn ym morffoleg SAM pCUC2::gai-1-VENUS arwain at ddosbarthiad gwahanol o straen mecanyddol o'i gymharu â'r math gwyllt, lle mae straen cylcheddol uchel yn dechrau ar bellter byrrach o ganol SAM47. Fel arall, gall y newidiadau ym morffoleg pCUC2::gai-1-VENUS SAM ddeillio o newidiadau mewn priodweddau mecanyddol rhanbarthol a achosir gan fynegiant trawsgenyn48. Yn y ddau achos, gallai hyn wrthbwyso effeithiau newidiadau mewn signalau GA yn rhannol trwy gynyddu'r tebygolrwydd y bydd celloedd yn rhannu yn y cyfeiriadedd cylcheddol/traws, gan egluro ein harsylwadau.
Gyda'i gilydd, mae ein data'n cadarnhau bod signalau GA uwch yn chwarae rhan weithredol yng nghyfeiriadedd ochrol y plân rhannu celloedd yn yr IPR. Maent hefyd yn dangos bod crymedd meristem hefyd yn dylanwadu ar gyfeiriadedd y plân rhannu celloedd yn yr IPR.
Mae cyfeiriadedd traws y plân rhannu yn yr IPR, oherwydd gweithgaredd signalau GA uchel, yn awgrymu bod GA yn trefnu ffeil gelloedd rheiddiol ymlaen llaw yn yr epidermis o fewn y SAM i ddiffinio'r drefniadaeth gellog a geir yn ddiweddarach yn yr internod epidermaidd. Yn wir, roedd ffeiliau celloedd o'r fath yn aml yn weladwy mewn delweddau SAM o mutantau della global (Ffig. 6b). Felly, er mwyn archwilio ymhellach swyddogaeth ddatblygiadol patrwm gofodol signalau GA yn y SAM, fe wnaethom ddefnyddio delweddu amser-osgoi i ddadansoddi trefniadaeth ofodol celloedd yn yr IPR mewn planhigion trawsgenig math gwyllt (Ler a Col-0), mutantau della global, a phlanhigion trawsgenig pCUC2::gai-1-VENUS.
Fe wnaethon ni ganfod bod qmRGA yn dangos bod gweithgaredd signalau GA yn yr IPR wedi cynyddu o P1/P2 ac wedi cyrraedd uchafbwynt yn P4, ac arhosodd y patrwm hwn yn gyson dros amser (Ffig. 4a–f a Ffig. Atodol 8c–f, k). I ddadansoddi trefniadaeth ofodol celloedd yn yr IPR gyda signal GA cynyddol, fe wnaethon ni labelu celloedd Ler IPR uwchben ac i ochrau P4 yn ôl eu tynged ddatblygiadol a ddadansoddwyd 34 awr ar ôl yr arsylwad gyntaf, h.y., mwy na dwy amser plastid, gan ganiatáu inni ddilyn celloedd IPR yn ystod datblygiad y primordiwm o P1/P2 i P4. Fe wnaethon ni ddefnyddio tri lliw gwahanol: melyn ar gyfer y celloedd hynny a oedd wedi'u hintegreiddio i'r primordiwm ger P4, gwyrdd ar gyfer y rhai a oedd yn yr IPR, a phorffor ar gyfer y rhai a gymerodd ran yn y ddau broses (Ffig. 7a–c). Ar t0 (0 awr), roedd 1–2 haen o gelloedd IPR yn weladwy o flaen P4 (Ffig. 7a). Fel y disgwyliwyd, pan rannodd y celloedd hyn, fe wnaethant hynny'n bennaf trwy'r plân rhannu traws (Ffigau 7a–c). Cafwyd canlyniadau tebyg gan ddefnyddio Col-0 SAM (gan ganolbwyntio ar P3, y mae ei ffin yn plygu'n debyg i P4 yn Ler), er yn y genoteip hwn roedd y plyg a ffurfiwyd ar y ffin flodeuog yn cuddio'r celloedd IPR yn gyflymach (Ffig. 7g–i). Felly, mae patrwm rhannu celloedd IPR yn trefnu'r celloedd ymlaen llaw yn rhesi rheiddiol, fel mewn internodau. Mae trefniadaeth rhesi rheiddiol a lleoliad celloedd IPR rhwng organau olynol yn awgrymu bod y celloedd hyn yn rhagflaenwyr internodol.
Yma, fe wnaethom ddatblygu biosynhwyrydd signalau GA ratiometrig, qmRGA, sy'n caniatáu mapio meintiol o weithgaredd signalau GA sy'n deillio o grynodiadau GA a derbynyddion GA cyfun wrth leihau ymyrraeth â llwybrau signalau endogenaidd, a thrwy hynny ddarparu gwybodaeth am swyddogaeth GA ar y lefel gellog. I'r perwyl hwn, fe wnaethom adeiladu protein DELLA wedi'i addasu, mRGA, sydd wedi colli'r gallu i rwymo partneriaid rhyngweithio DELLA ond sy'n parhau i fod yn sensitif i broteolysis a achosir gan GA. Mae qmRGA yn ymateb i newidiadau alldarddol ac endogenaidd mewn lefelau GA, ac mae ei briodweddau synhwyro deinamig yn galluogi asesu newidiadau gofod-amserol mewn gweithgaredd signalau GA yn ystod datblygiad. Mae qmRGA hefyd yn offeryn hyblyg iawn gan y gellir ei addasu i wahanol feinweoedd trwy newid yr hyrwyddwr a ddefnyddir ar gyfer ei fynegiant (os oes angen), ac o ystyried natur gadwedig y llwybr signalau GA a'r motiff PFYRE ar draws angiospermau, mae'n debygol y gellir ei drosglwyddo i rywogaethau eraill22. Yn gyson â hyn, dangoswyd hefyd fod mwtaniad cyfatebol yn y protein reis SLR1 DELLA (HYY497AAA) yn atal gweithgaredd atalydd twf SLR1 tra'n lleihau ei ddiraddiad a gyfryngir gan GA ychydig yn unig, yn debyg i mRGA23. Yn nodedig, dangosodd astudiaethau diweddar yn Arabidopsis fod un mwtaniad asid amino yn y parth PFYRE (S474L) wedi newid gweithgaredd trawsgrifio RGA heb effeithio ar ei allu i ryngweithio â phartneriaid ffactor trawsgrifio50. Er bod y mwtaniad hwn yn agos iawn at y 3 amnewidiad asid amino sy'n bresennol yn mRGA, mae ein hastudiaethau'n dangos bod y ddau fwtaniad hyn yn newid nodweddion penodol DELLA. Er bod y rhan fwyaf o bartneriaid ffactor trawsgrifio yn rhwymo i barthau LHR1 a SAW DELLA26,51, gall rhai asidau amino cadwedig yn y parth PFYRE helpu i sefydlogi'r rhyngweithiadau hyn.
Mae datblygiad internodau yn nodwedd allweddol mewn pensaernïaeth planhigion a gwella cynnyrch. Datgelodd qmRGA weithgarwch signalau GA uwch mewn celloedd rhagflaenydd internodau IPR. Trwy gyfuno delweddu meintiol a geneteg, dangoson ni fod patrymau signalau GA yn gorchuddio awyrennau rhannu celloedd crwn/traws yn epidermis SAM, gan lunio'r drefniadaeth rhannu celloedd sy'n ofynnol ar gyfer datblygiad internodau. Mae sawl rheolydd cyfeiriadedd awyren rhannu celloedd wedi'u nodi yn ystod y datblygiad52,53. Mae ein gwaith yn darparu enghraifft glir o sut mae gweithgaredd signalau GA yn rheoleiddio'r paramedr cellog hwn. Gall DELLA ryngweithio â chyfadeiladau protein cyn-blygu41, felly gall signalau GA reoleiddio cyfeiriadedd awyren rhannu celloedd trwy ddylanwadu'n uniongyrchol ar gyfeiriadedd microtubule cortigol40,41,54,55. Dangoson ni'n annisgwyl, yn SAM, nad ymestyn neu rannu celloedd oedd cydberthynas gweithgaredd signalau GA uwch, ond anisotropi twf yn unig, sy'n gyson ag effaith uniongyrchol GA ar gyfeiriad rhannu celloedd yn yr IPR. Fodd bynnag, ni allwn eithrio y gallai'r effaith hon fod yn anuniongyrchol hefyd, er enghraifft wedi'i chyfryngu gan feddalu waliau celloedd a achosir gan GA56. Mae newidiadau ym mhriodweddau waliau celloedd yn achosi straen mecanyddol57,58, a all hefyd ddylanwadu ar gyfeiriadedd y plân rhannu celloedd trwy effeithio ar gyfeiriadedd microdiwbynnau cortigol39,46,59. Gall effeithiau cyfunol straen mecanyddol a achosir gan GA a rheoleiddio uniongyrchol cyfeiriadedd microdiwbynnau gan GA fod yn rhan o gynhyrchu patrwm penodol o gyfeiriadedd rhannu celloedd yn yr IPR i ddiffinio internodau, ac mae angen astudiaethau pellach i brofi'r syniad hwn. Yn yr un modd, mae astudiaethau blaenorol wedi tynnu sylw at bwysigrwydd y proteinau TCP14 a 15 sy'n rhyngweithio â DELLA wrth reoli ffurfio internodau60,61 a gall y ffactorau hyn gyfryngu gweithred GA ynghyd â BREVIPEDICELLUS (BP) a PENNYWISE (PNY), sy'n rheoleiddio datblygiad internodau ac y dangoswyd eu bod yn dylanwadu ar signalau GA2,62. O ystyried bod DELLAs yn rhyngweithio â llwybrau signalau brassinosteroid, ethylen, asid jasmonig, ac asid abscisig (ABA)63,64 a bod yr hormonau hyn yn gallu dylanwadu ar gyfeiriadedd microtubules65, gall effeithiau GA ar gyfeiriadedd rhaniad celloedd hefyd gael eu cyfryngu gan hormonau eraill.
Dangosodd astudiaethau cytolegol cynnar fod angen rhanbarthau mewnol ac allanol SAM Arabidopsis ar gyfer datblygiad internodau2,42. Mae'r ffaith bod GA yn rheoleiddio rhaniad celloedd yn weithredol yn y meinweoedd mewnol12 yn cefnogi swyddogaeth ddeuol GA wrth reoleiddio meristem a maint internodau yn y SAM. Mae patrwm rhaniad celloedd cyfeiriadol hefyd wedi'i reoleiddio'n dynn ym meinwe fewnol yr SAM, ac mae'r rheoleiddio hwn yn hanfodol ar gyfer twf coesyn52. Bydd yn ddiddorol archwilio a yw GA hefyd yn chwarae rhan wrth gyfeirio'r plân rhaniad celloedd yn nhrefniadaeth fewnol yr SAM, a thrwy hynny gydamseru manyleb a datblygiad internodau o fewn yr SAM.
Tyfwyd planhigion in vitro mewn pridd neu gyfrwng 1x Murashige-Skoog (MS) (Duchefa) wedi'i ategu ag 1% swcros ac 1% agar (Sigma) o dan amodau safonol (16 awr o olau, 22 °C), ac eithrio arbrofion hypocotyl a thwf gwreiddiau lle tyfwyd eginblanhigion ar blatiau fertigol o dan olau cyson a 22 °C. Ar gyfer arbrofion nitrad, tyfwyd planhigion ar gyfrwng MS wedi'i addasu (cyfrwng planhigion bioWORLD) wedi'i ategu â digon o nitrad (0 neu 10 mM KNO3), 0.5 mM NH4-swcsad, 1% swcros ac 1% A-agar (Sigma) o dan amodau diwrnod hir.
Cafodd cDNA GID1a a fewnosodwyd i pDONR221 ei ailgyfuno â pDONR P4-P1R-pUBQ10 a pDONR P2R-P3-mCherry i mewn i pB7m34GW i gynhyrchu pUBQ10::GID1a-mCherry. Cafodd DNA IDD2 a fewnosodwyd i pDONR221 ei ailgyfuno i mewn i pB7RWG266 i gynhyrchu p35S:IDD2-RFP. I gynhyrchu pGID1b::2xmTQ2-GID1b, cafodd darn 3.9 kb i fyny'r afon o ranbarth codio GID1b a darn 4.7 kb yn cynnwys y cDNA GID1b (1.3 kb) a'r terfynydd (3.4 kb) eu mwyhau yn gyntaf gan ddefnyddio'r primerau yn Nhabl Atodol 3 ac yna eu mewnosod i mewn i pDONR P4-P1R (Thermo Fisher Scientific) a pDONR P2R-P3 (Thermo Fisher Scientific), yn y drefn honno, ac yn olaf eu hailgyfuno â pDONR221 2xmTQ268 i'r fector targed pGreen 012567 gan ddefnyddio clonio Porth. I gynhyrchu pCUC2::LSSmOrange, cafodd dilyniant hyrwyddwr CUC2 (3229 bp i fyny'r afon o ATG) ac yna dilyniant codio mOrange mawr wedi'i symud gan Stokes (LSSmOrange)69 gyda'r signal lleoleiddio niwclear N7 a'r terfynydd trawsgrifio NOS eu cydosod i'r fector targedu kanamycin pGreen gan ddefnyddio'r system ailgyfuno 3-darn Gateway (Invitrogen). Cyflwynwyd y fector deuaidd planhigion i straen Agrobacterium tumefaciens GV3101 a'i gyflwyno i ddail Nicotiana benthamiana trwy'r dull ymdreiddiad Agrobacterium ac i Arabidopsis thaliana Col-0 trwy'r dull trochi blodau, yn y drefn honno. Ynysigwyd pUBQ10::qmRGA pUBQ10::GID1a-mCherry a pCLV3::mCherry-NLS qmRGA o epil F3 ac F1 y croesiadau priodol, yn y drefn honno.
Perfformiwyd hybridio RNA in situ ar flaenau egin tua 1 cm o hyd72, a gasglwyd a'u trwsio ar unwaith mewn hydoddiant FAA (3.7% fformaldehyd, 5% asid asetig, 50% ethanol) wedi'i oeri ymlaen llaw i 4 °C. Ar ôl triniaethau gwactod 2 × 15 munud, newidiwyd y trwsio a deorwyd y samplau dros nos. Syntheseiddiwyd cDNA GID1a, GID1b, GID1c, GAI, RGL1, RGL2, ac RGL3 a phrobau gwrth-synnwyr i'w 3′-UTRs gan ddefnyddio'r primerau a ddangosir yn Nhabl Atodol 3 fel y disgrifiwyd gan Rosier et al.73. Cafodd stilwyr wedi'u labelu â digoxigenin eu himiwnoddanfod gan ddefnyddio gwrthgyrff digoxigenin (gwanhad 3000 gwaith; Roche, rhif catalog: 11 093 274 910), a staeniwyd adrannau â thoddiant 5-bromo-4-chloro-3-indolyl ffosffad (BCIP, gwanhad 250 gwaith)/nitroblue tetrazolium (NBT, gwanhad 200 gwaith).
Amser postio: Chwefror-10-2025