Mae twf meristem apical saethu (SAM) yn hanfodol ar gyfer pensaernïaeth coesyn. Hormonau planhigiongibberellins(GAs) yn chwarae rhan allweddol wrth gydlynu twf planhigion, ond mae eu rôl yn yr Heneb Restredig yn dal i gael ei deall yn wael. Yma, rydym wedi datblygu biosynhwyrydd cymesurol o signalau GA trwy beiriannu'r protein DELLA i atal ei swyddogaeth reoleiddiol hanfodol yn yr ymateb trawsgrifiadol GA tra'n cadw ei ddiraddiad ar gydnabyddiaeth GA. Rydym yn dangos bod y biosynhwyrydd hwn sy'n seiliedig ar ddiraddiad yn cofnodi'n gywir newidiadau mewn lefelau GA a synhwyro cellog yn ystod datblygiad. Defnyddiwyd y biosynhwyrydd hwn i fapio gweithgarwch signalau GA yn y SAM. Rydym yn dangos bod signalau GA uchel yn bresennol yn bennaf mewn celloedd sydd wedi'u lleoli rhwng organ primordia, sy'n rhagflaenwyr i gelloedd internode. Gan ddefnyddio dulliau ennill a cholli swyddogaeth, rydym yn dangos ymhellach bod GA yn rheoleiddio cyfeiriadedd yr awyren cellraniad, gan sefydlu trefniadaeth gellog canonaidd internodes, a thrwy hynny hyrwyddo manyleb internod yn yr SAM.
Mae'r meristem apical saethu (SAM), sydd wedi'i leoli ar frig yr egin, yn cynnwys cilfach o fôn-gelloedd y mae eu gweithgaredd yn cynhyrchu organau ochrol a nodau coesyn mewn modd modiwlaidd ac ailadroddol trwy gydol oes y planhigyn. Mae pob un o'r unedau ailadroddus hyn, neu nodau planhigion, yn cynnwys internodes ac organau ochrol yn y nodau, a meristemau echelinol yng ngheginau'r dail1. Mae twf a threfniadaeth nodau planhigion yn newid yn ystod datblygiad. Yn Arabidopsis, mae twf internodal yn cael ei atal yn ystod y cyfnod llystyfol, ac mae meristemau echelinol yn parhau i fod ynghwsg yn echelinau dail rhoséd. Yn ystod y trawsnewid i'r cyfnod blodeuol, mae'r SAM yn dod yn meristem inflorescence, gan gynhyrchu internodes hir a blagur echelinaidd, canghennau yn echelinau dail cauline, ac yn ddiweddarach, blodau heb ddeilen2. Er ein bod wedi gwneud cynnydd sylweddol o ran deall y mecanweithiau sy'n rheoli cychwyniad dail, blodau a changhennau, cymharol ychydig a wyddys am sut mae internodes yn codi.
Bydd deall dosbarthiad ysbeidiol o GA yn helpu i ddeall swyddogaethau'r hormonau hyn yn well mewn gwahanol feinweoedd ac ar wahanol gamau datblygiadol. Mae delweddu diraddio ymasiad RGA-GFP a fynegir o dan weithred ei hyrwyddwr ei hun yn darparu gwybodaeth bwysig ar reoleiddio cyfanswm lefelau GA mewn gwreiddiau15,16. Fodd bynnag, mae mynegiant RGA yn amrywio ar draws meinweoedd17 ac yn cael ei reoleiddio gan GA18. Felly, gall mynegiant gwahaniaethol yr hyrwyddwr RGA arwain at y patrwm fflworoleuedd a welwyd gyda RGA-GFP ac felly nid yw'r dull hwn yn feintiol. Yn fwy diweddar, datgelodd GA19,20 wedi'i labelu â fflworoleuedd bioactif (Fl) fod GA19,20 wedi cronni yn yr endocortex gwraidd a rheoleiddio ei lefelau cellog gan gludiant GA. Yn ddiweddar, dangosodd synhwyrydd GA FRET nlsGPS1 fod lefelau GA yn cyfateb i ehangiad celloedd mewn gwreiddiau, ffilamentau, a hypocotylau wedi'u tyfu'n dywyll21. Fodd bynnag, fel y gwelsom, nid crynodiad GA yw'r unig baramedr sy'n rheoli gweithgaredd signalau GA, gan ei fod yn dibynnu ar brosesau synhwyro cymhleth. Yma, gan adeiladu ar ein dealltwriaeth o lwybrau signalau DELLA a GA, rydym yn adrodd ar ddatblygiad a nodweddu biosynhwyrydd cymarebau ar sail diraddio ar gyfer signalau GA. I ddatblygu'r biosynhwyrydd meintiol hwn, fe wnaethom ddefnyddio RGA mutant-sensitif GA a gafodd ei asio i brotein fflwroleuol a'i fynegi'n hollbresennol mewn meinweoedd, yn ogystal â phrotein fflworoleuol GA-ansensitif. Rydym yn dangos nad yw ymasiadau protein RGA mutant yn ymyrryd â signalau GA mewndarddol o'u mynegi'n hollbresennol, ac y gall y biosynhwyrydd hwn feintioli gweithgaredd signalau sy'n deillio o fewnbwn GA a phrosesu signal GA gan y cyfarpar synhwyro gyda chydraniad spatiotemporal uchel. Defnyddiwyd y biosynhwyrydd hwn i fapio dosbarthiad gofodol gweithgaredd signalau GA a meintioli sut mae GA yn rheoleiddio ymddygiad cellog yn yr epidermis SAM. Rydym yn dangos bod GA yn rheoleiddio cyfeiriadedd plân rhannu celloedd SAM sydd wedi'u lleoli rhwng organ primordia, a thrwy hynny ddiffinio trefniadaeth gellog canonaidd yr internode.
Yn olaf, gofynnwyd a allai qmRGA adrodd ar newidiadau mewn lefelau GA mewndarddol gan ddefnyddio hypocotylau cynyddol. Fe wnaethom ddangos yn flaenorol fod nitrad yn ysgogi twf trwy gynyddu synthesis GA ac, yn ei dro, diraddio DELLA34. Yn unol â hynny, gwelsom fod hyd hypocotyl yn pUBQ10::qmRGA eginblanhigion a dyfwyd o dan gyflenwad nitrad helaeth (10 mM NO3 -) yn sylweddol hirach na'r hyn mewn eginblanhigion a dyfwyd o dan amodau diffyg nitrad (Atodol Ffig. 6a). Yn gyson â'r ymateb twf, roedd signalau GA yn uwch mewn hypocotylau o eginblanhigion a dyfwyd o dan amodau 10 mM NO3 - nag mewn eginblanhigion a dyfwyd yn absenoldeb nitrad (Ffig Atodol 6b, c). Felly, mae qmRGA hefyd yn galluogi monitro newidiadau mewn signalau GA a achosir gan newidiadau mewndarddol mewn crynodiad GA.
Er mwyn deall a yw gweithgaredd signalau GA a ganfyddir gan qmRGA yn dibynnu ar grynodiad GA a chanfyddiad GA, yn ôl y disgwyl yn seiliedig ar ddyluniad y synhwyrydd, dadansoddwyd mynegiant y tri derbynnydd GID1 mewn meinweoedd llystyfol ac atgenhedlu. Mewn eginblanhigion, dangosodd llinell gohebydd GID1-GUS fod GID1a ac c wedi'u mynegi'n fawr mewn cotyledonau (Ffig. 3a–c). Yn ogystal, mynegwyd y tri derbynnydd mewn dail, primordia gwraidd ochrol, blaenau gwreiddiau (ac eithrio cap gwraidd GID1b), a'r system fasgwlaidd (Ffig. 3a-c). Yn y SAM inflorescence, rydym yn canfod signalau GUS yn unig ar gyfer GID1b ac 1c (Atodol Ffig. 7a-c). Cadarnhaodd hybridization in situ y patrymau mynegiant hyn a dangosodd ymhellach fod GID1c wedi'i fynegi'n unffurf ar lefelau isel yn y SAM, tra bod GID1b yn dangos mynegiant uwch ar gyrion y SAM (Ffig Atodol 7d-l). Datgelodd ymasiad trosiadol pGID1b::2xmTQ2-GID1b hefyd amrediad graddedig o fynegiad GID1b, o fynegiant isel neu ddim mynegiant yng nghanol yr Heneb Restredig i fynegiant uchel ar ffiniau'r organau (Ffig Atodol 7m). Felly, nid yw derbynyddion GID1 wedi'u dosbarthu'n unffurf ar draws meinweoedd ac oddi mewn iddynt. Mewn arbrofion dilynol, gwelsom hefyd fod gorfynegiant GID1 (pUBQ10::GID1a-mCherry) yn cynyddu sensitifrwydd qmRGA mewn hypocotylau i gymhwyso GA allanol (Ffig. 3d, e). Mewn cyferbyniad, roedd fflworoleuedd a fesurwyd gan qd17mRGA yn yr hypocotyl yn ansensitif i driniaeth GA3 (Ffig. 3f, g). Ar gyfer y ddau brawf, cafodd eginblanhigion eu trin â chrynodiadau uchel o GA (100 μM GA3) i asesu ymddygiad cyflym y synhwyrydd, lle cafodd y gallu i rwymo i'r derbynnydd GID1 ei wella neu ei golli. Gyda'i gilydd, mae'r canlyniadau hyn yn cadarnhau bod y biosynhwyrydd qmRGA yn gwasanaethu swyddogaeth gyfunol fel synhwyrydd GA a GA, ac yn awgrymu y gall mynegiant gwahaniaethol y derbynnydd GID1 fodiwleiddio emissivity y synhwyrydd yn sylweddol.
Hyd yn hyn, mae dosbarthiad signalau GA yn yr Heneb Restredig yn parhau i fod yn aneglur. Felly, rydym yn defnyddio planhigion qmRGA-mynegi a'r pCLV3:: gohebydd bôn-gelloedd mCherry-NLS35 i gyfrifo mapiau meintiol cydraniad uchel o weithgaredd signalau GA, gan ganolbwyntio ar yr haen L1 (epidermis; Ffig. 4a, b, gweler Dulliau a Dulliau Atodol), gan fod L1 yn chwarae rhan allweddol wrth reoli twf SAM. Yma, roedd mynegiant pCLV3::mCherry-NLS yn darparu pwynt cyfeirio geometrig sefydlog ar gyfer dadansoddi dosbarthiad gofodol amseriadol gweithgaredd signalau GA37. Er bod GA yn cael ei ystyried yn hanfodol ar gyfer datblygu organau ochrol4, gwelsom fod signalau GA yn isel yn y primordium blodeuog (P) gan ddechrau o'r cyfnod P3 (Ffig. 4a, b), tra bod gan primordiums ifanc P1 a P2 weithgaredd cymedrol tebyg i'r hyn a geir yn y rhanbarth canolog (Ffig. 4a, b). Canfuwyd gweithgaredd signalau GA uwch ar ffiniau primordium yr organ, gan ddechrau yn P1/P2 (ar ochrau'r ffin) ac yn cyrraedd uchafbwynt yn P4, yn ogystal ag ym mhob cell yn y rhanbarth ymylol a leolir rhwng y primordia (Ffig. 4a, b a Ffig Atodol 8a, b). Arsylwyd y gweithgaredd signalau GA uwch hwn nid yn unig yn yr epidermis ond hefyd yn yr haenau L2 a L3 uchaf (Ffig Atodol 8b). Arhosodd patrwm y signalau GA a ganfuwyd yn y SAM gan ddefnyddio qmRGA hefyd yn ddigyfnewid dros amser (Ffig Atodol 8c–f, k). Er bod y lluniad qd17mRGA wedi'i isreoleiddio'n systematig yn SAM o blanhigion T3 o bum llinell annibynnol a nodweddwyd gennym yn fanwl, roeddem yn gallu dadansoddi'r patrymau fflworoleuedd a gafwyd gyda'r pRPS5a:: VenUS-2A-TagBFP construct (Ffig Atodol 8g-j, l). Yn y llinell reoli hon, dim ond mân newidiadau yn y gymhareb fflworoleuedd a ganfuwyd yn yr SAM, ond yn y ganolfan SAM gwelsom ostyngiad clir ac annisgwyl yn VENUS sy'n gysylltiedig â TagBFP. Mae hyn yn cadarnhau bod y patrwm signalau a welwyd gan qmRGA yn adlewyrchu diraddiad mRGA-VENUS sy'n ddibynnol ar GA, ond mae hefyd yn dangos y gallai qmRGA oramcangyfrif gweithgaredd signalau GA yn y ganolfan meristem. I grynhoi, mae ein canlyniadau'n datgelu patrwm signalau GA sy'n adlewyrchu dosbarthiad primordia yn bennaf. Mae'r dosbarthiad hwn o'r rhanbarth rhyng-primordial (IPR) yn ganlyniad i sefydlu gweithgaredd signalau GA uchel yn raddol rhwng y primordium sy'n datblygu a'r rhanbarth canolog, tra ar yr un pryd mae gweithgaredd signalau GA yn y primordium yn lleihau (Ffig. 4c, d).
Mae dosbarthiad derbynyddion GID1b a GID1c (gweler uchod) yn awgrymu bod mynegiant gwahaniaethol derbynyddion GA yn helpu i siapio patrwm gweithgaredd signalau GA yn y SAM. Roeddem yn meddwl tybed a allai croniad gwahaniaethol o GA fod yn gysylltiedig. I ymchwilio i'r posibilrwydd hwn, defnyddiwyd y synhwyrydd nlsGPS1 GA FRET21. Canfuwyd amledd actifadu cynyddol yn SAM o nlsGPS1 wedi'i drin â 10 μM GA4+7 am 100 munud (Ffig Atodol 9a-e), sy'n dangos bod nlsGPS1 yn ymateb i newidiadau mewn crynodiad GA yn y SAM, fel y mae yn y gwreiddiau21. Datgelodd dosbarthiad gofodol amledd actifadu nlsGPS1 lefelau GA cymharol isel yn haenau allanol y SAM, ond dangosodd eu bod wedi'u dyrchafu yn y canol ac ar ffiniau'r SAM (Ffig. 4e a Ffig Atodol 9a,c). Mae hyn yn awgrymu bod GA hefyd yn cael ei ddosbarthu yn yr Heneb Restredig gyda phatrwm gofodol tebyg i'r hyn a ddatgelir gan qmRGA. Fel dull cyflenwol, gwnaethom hefyd drin yr SAM â fflwroleuol GA (GA3-, GA4-, GA7-Fl) neu Fl yn unig fel rheolaeth negyddol. Dosbarthwyd y signal Fl trwy'r SAM, gan gynnwys y rhanbarth canolog a'r primordium, er ar ddwysedd is (Ffig. 4j a Ffig Atodol 10d). Mewn cyferbyniad, cronnodd y tri GA-Fl yn benodol o fewn ffiniau'r primordium ac i raddau amrywiol yng ngweddill yr IPR, gyda GA7-Fl yn cronni yn y parth mwyaf yn yr IPR (Ffig. 4k a Ffig Atodol 10a,b). Datgelodd meintioli dwyster fflworoleuedd fod y gymhareb dwyster IPR i ddi-IPR yn uwch mewn SAM wedi'i drin gan GA-Fl o'i gymharu â SAM wedi'i drin â F (Ffig. 4l a Ffig Atodol. 10c). Gyda'i gilydd, mae'r canlyniadau hyn yn awgrymu bod GA yn bresennol mewn crynodiadau uwch mewn celloedd IPR sydd wedi'u lleoli agosaf at ffin yr organau. Mae hyn yn awgrymu bod patrwm gweithgaredd signalau SAM GA yn deillio o fynegiant gwahaniaethol derbynyddion GA a chroniad gwahaniaethol o GA mewn celloedd IPR ger ffiniau organau. Felly, datgelodd ein dadansoddiad batrwm spatiotemporal annisgwyl o signalau GA, gyda gweithgaredd is yng nghanol a primordium yr SAM a gweithgaredd uwch yn yr IPR yn y rhanbarth ymylol.
Er mwyn deall rôl gweithgaredd signalau GA gwahaniaethol yn yr SAM, dadansoddwyd y gydberthynas rhwng gweithgaredd signalau GA, ehangu celloedd, a rhannu celloedd gan ddefnyddio delweddu treigl amser amser real o SAM qmRGA pCLV3::mCherry-NLS. O ystyried rôl GA mewn rheoleiddio twf, disgwyliwyd cydberthynas gadarnhaol â pharamedrau ehangu celloedd. Felly, fe wnaethom gymharu mapiau gweithgaredd signalau GA yn gyntaf â mapiau o gyfradd twf arwyneb celloedd (fel dirprwy ar gyfer cryfder ehangu celloedd ar gyfer cell benodol ac ar gyfer epilgelloedd wrth rannu) a gyda mapiau o anisotropi twf, sy'n mesur cyfeiriadedd ehangu celloedd (a ddefnyddir yma hefyd ar gyfer cell benodol ac ar gyfer epilgelloedd wrth rannu; Ffig. 5a,b, gweler Dulliau a Dulliau Atodol). Mae ein mapiau o gyfradd twf arwyneb celloedd SAM yn gyson ag arsylwadau blaenorol38,39, gyda chyfraddau twf lleiaf posibl ar y ffin a chyfraddau twf uchaf wrth ddatblygu blodau (Ffig. 5a). Dangosodd dadansoddiad prif gydrannau (PCA) fod cydberthynas negyddol rhwng gweithgaredd signalau GA a dwyster twf arwyneb celloedd (Ffigur 5c). Gwnaethom hefyd ddangos bod y prif echelinau amrywiad, gan gynnwys mewnbwn signalau GA a dwyster twf, yn orthogonal i'r cyfeiriad a bennwyd gan fynegiant CLV3 uchel, gan gadarnhau eithrio celloedd o'r ganolfan SAM yn y dadansoddiadau sy'n weddill. Cadarnhaodd dadansoddiad cydberthynas Spearman y canlyniadau PCA (Ffigur 5d), gan nodi nad oedd signalau GA uwch yn yr IPR yn arwain at ehangu celloedd uwch. Fodd bynnag, datgelodd dadansoddiad cydberthynas ychydig o gydberthynas gadarnhaol rhwng gweithgaredd signalau GA ac anisotropi twf (Ffigur 5c, d), gan awgrymu bod signalau GA uwch yn yr IPR yn dylanwadu ar gyfeiriad twf celloedd ac o bosibl lleoliad yr awyren cellraniad.
a, b Roedd cyfartaledd mapiau gwres o dwf arwyneb cymedrig (a) ac anisotropi twf (b) yn SAM dros saith planhigyn annibynnol (a ddefnyddir fel dirprwy ar gyfer cryfder a chyfeiriad ehangiad celloedd, yn y drefn honno). c Roedd dadansoddiad PCA yn cynnwys y newidynnau canlynol: signal GA, dwyster twf arwyneb, anisotropi twf arwyneb, a mynegiant CLV3. Roedd cydberthynas negyddol yn bennaf rhwng cydran PCA 1 a dwyster twf arwyneb a chydberthynas gadarnhaol â signal GA. Roedd cydberthynas gadarnhaol rhwng cydran 2 PCA yn bennaf ag anisotropi twf arwyneb a'i gydberthynas negyddol â mynegiant CLV3. Mae'r canrannau'n cynrychioli'r amrywiad a eglurir gan bob cydran. d Dadansoddiad cydberthynas Spearman rhwng signal GA, dwyster twf arwyneb, ac anisotropi twf arwyneb ar y raddfa feinwe ac eithrio CZ. Y rhif ar y dde yw gwerth rho Spearman rhwng dau newidyn. Mae seren yn dynodi achosion lle mae'r gydberthynas/cydberthynas negyddol yn arwyddocaol iawn. e Delweddu 3D o gelloedd Col-0 SAM L1 trwy ficrosgopeg confocal. Mae cellfuriau newydd a ffurfiwyd yn y SAM (ond nid y primordium) ar 10 h wedi'u lliwio yn ôl eu gwerthoedd ongl. Dangosir y bar lliw yn y gornel dde isaf. Mae'r mewnosodiad yn dangos y ddelwedd 3D cyfatebol ar 0 h. Ailadroddwyd yr arbrawf ddwywaith gyda chanlyniadau tebyg. f Mae plotiau blwch yn dangos cyfraddau cellraniad yn IPR a di-IPR Col-0 SAM (n = 10 o weithfeydd annibynnol). Mae'r llinell ganol yn dangos y canolrif, ac mae ffiniau'r blychau yn nodi'r 25ain a'r 75ain canradd. Mae wisgers yn nodi'r gwerthoedd lleiaf ac uchaf a bennir gyda meddalwedd R. Cafwyd gwerthoedd P gyda phrawf t dwy gynffon Welch. g, h Diagram sgematig yn dangos (e) sut i fesur ongl y cellfur newydd (magenta) mewn perthynas â'r cyfeiriad rheiddiol o ganol y SAM (llinell ddotiog wen) (dim ond gwerthoedd ongl lem, h.y., 0–90°, sy'n cael eu hystyried), a (h) y cyfeiriad amgylchiadol/ochrol a rheiddiol o fewn y meristem. i Histogramau amledd o gyfeiriadedd planau cellraniad ar draws yr SAM (glas tywyll), IPR (glas canolig), a heb fod yn IPR (glas golau), yn y drefn honno. Cafwyd gwerthoedd P trwy brawf Kolmogorov-Smirnov dwy gynffon. Ailadroddwyd yr arbrawf ddwywaith gyda chanlyniadau tebyg. j Histogramau amledd o gyfeiriadedd plân rhaniad celloedd yr IPR o amgylch P3 (gwyrdd golau), P4 (gwyrdd canolig), a P5 (gwyrdd tywyll), yn y drefn honno. Cafwyd gwerthoedd P trwy brawf Kolmogorov-Smirnov dwy-gynffon. Ailadroddwyd yr arbrawf ddwywaith gyda chanlyniadau tebyg.
Felly, gwnaethom ymchwilio nesaf i'r gydberthynas rhwng signalau GA a gweithgaredd rhannu celloedd trwy nodi cellfuriau sydd newydd eu ffurfio yn ystod yr assay (Ffig. 5e). Roedd y dull hwn yn ein galluogi i fesur amlder a chyfeiriad cellraniad. Yn syndod, canfuom fod amlder rhaniadau celloedd yn yr IPR a gweddill yr SAM (di-IPR, Ffig. 5f) yn debyg, gan nodi nad yw gwahaniaethau mewn signalau GA rhwng celloedd IPR a chelloedd nad ydynt yn IPR yn effeithio'n sylweddol ar raniad celloedd. Fe wnaeth hyn, a'r gydberthynas gadarnhaol rhwng signalau GA ac anisotropi twf, ein hysgogi i ystyried a allai gweithgaredd signalau GA ddylanwadu ar gyfeiriadedd yr awyren cellraniad. Fe wnaethom fesur cyfeiriadedd y cellfur newydd fel ongl lem o'i gymharu â'r echelin rheiddiol sy'n cysylltu'r ganolfan meristem a chanol y wal gell newydd (Ffig. 5e-i) a gwelsom duedd amlwg i gelloedd rannu ar onglau yn agos at 90 ° o'u cymharu â'r echelin rheiddiol, gyda'r amleddau uchaf yn 70-80 ° (23.28%) (23.28%). 5e,i), yn cyfateb i gell rhaniadau yn y cyfeiriad cylchedd/trawsnewidiol (Ffig. 5h). I archwilio cyfraniad signalau GA i'r ymddygiad cellraniad hwn, dadansoddwyd paramedrau rhaniad celloedd yn yr IPR a'r rhai nad ydynt yn IPR ar wahân (Ffig. 5i). Gwelsom fod y dosbarthiad ongl rhannu mewn celloedd IPR yn wahanol i'r dosbarthiad mewn celloedd nad ydynt yn IPR neu mewn celloedd yn y SAM cyfan, gyda chelloedd IPR yn arddangos cyfran uwch o adrannau cell ochrol / cylchol, hy, 70-80 ° a 80-90 ° (33.86% a 30.71%, yn y drefn honno, cyfrannau cyfatebol) (Ffig. 5i). Felly, datgelodd ein harsylwadau gysylltiad rhwng signalau GA uchel a chyfeiriadedd awyren cellraniad yn agos at y cyfeiriad cylchedd, yn debyg i'r gydberthynas rhwng gweithgaredd signalau GA ac anisotropi twf (Ffig. 5c, d). Er mwyn sefydlu cadwraeth ofodol y cysylltiad hwn ymhellach, fe wnaethom fesur cyfeiriadedd yr awyren adrannol mewn celloedd IPR o amgylch y primordium gan ddechrau o P3, gan fod y gweithgaredd signalau GA uchaf wedi'i ganfod yn y rhanbarth hwn gan ddechrau o P4 (Ffig. 4). Nid oedd onglau rhannu'r IPR o amgylch P3 a P4 yn dangos unrhyw wahaniaethau ystadegol arwyddocaol, er bod amlder cynyddol o raniadau celloedd ochrol i'w weld yn yr IPR o gwmpas P4 (Ffig. 5j). Fodd bynnag, yn y celloedd IPR o gwmpas P5, daeth y gwahaniaeth yng nghyfeiriadedd yr awyren cellraniad yn ystadegol arwyddocaol, gyda chynnydd sydyn yn amlder rhaniadau celloedd traws (Ffig. 5j). Gyda'i gilydd, mae'r canlyniadau hyn yn awgrymu y gall signalau GA reoli cyfeiriadedd rhaniadau celloedd yn y SAM, sy'n gyson ag adroddiadau blaenorol40,41 y gall signalau GA uchel achosi cyfeiriadedd ochrol rhaniadau celloedd yn yr IPR.
Rhagwelir na fydd celloedd yn yr IPR yn cael eu hymgorffori mewn primordia ond yn hytrach mewn internodau2,42,43. Gall cyfeiriadedd traws rhaniadau celloedd yn yr IPR arwain at drefniadaeth nodweddiadol rhesi hydredol cyfochrog o gelloedd epidermaidd mewn internodau. Mae ein harsylwadau a ddisgrifir uchod yn awgrymu bod signalau GA yn debygol o chwarae rhan yn y broses hon trwy reoleiddio cyfeiriad rhaniad celloedd.
Mae colli swyddogaeth nifer o enynnau DELLA yn arwain at ymateb GA cyfansoddol, a gellir defnyddio della mutants i brofi'r ddamcaniaeth hon44. Yn gyntaf fe wnaethom ddadansoddi patrymau mynegiant pum genyn DELLA yn yr SAM. Datgelodd ymasiad trawsgrifiadol o'r llinell GUS45 fod GAI, RGA, RGL1, a RGL2 (i raddau llawer llai) wedi'u mynegi yn y SAM (Ffig Atodol 11a-d). Dangosodd hybridization in situ ymhellach fod GAI mRNA yn cronni'n benodol mewn primordia a blodau sy'n datblygu (Ffig Atodol 11e). RGL1 a RGL3 mRNA eu canfod drwy gydol y canopi SAM ac mewn blodau hŷn, tra bod RGL2 mRNA yn fwy helaeth yn y rhanbarth ffin (Atodol Ffig. 11f-h). Delweddu confocal o pRGL3::RGL3-GFP Cadarnhaodd SAM y mynegiant a welwyd gan hybridization in situ a dangosodd fod protein RGL3 yn cronni yn rhan ganolog y SAM (Ffig Atodol 11i). Gan ddefnyddio'r llinell pRGA::GFP-RGA, canfuom hefyd fod protein RGA yn cronni yn y SAM, ond mae ei helaethrwydd yn lleihau ar y ffin gan ddechrau o P4 (Ffig Atodol 11j). Yn nodedig, mae patrymau mynegiant RGL3 ac RGA yn gyson â gweithgaredd signalau GA uwch yn yr IPR, fel y'i canfuwyd gan qmRGA (Ffig. 4). At hynny, mae'r data hyn yn dangos bod yr holl DELLAs wedi'u mynegi yn y SAM a bod eu mynegiant gyda'i gilydd yn rhychwantu'r SAM cyfan.
Nesaf, rydym yn dadansoddi'r paramedrau cellraniad yn y gwyllt-math SAM (Ler, rheolaeth) a'r gai-t6 rga-t2 rgl1-1 rgl2-1 rgl3-4 della quintuple (byd-eang) mutants (Ffig. 6a, b). Yn ddiddorol, rydym yn arsylwi symudiad ystadegol arwyddocaol yn y dosbarthiad o amleddau onglau rhannu cell yn y byd-eang della mutant SAM o'i gymharu â'r math gwyllt ( Ffig. 6c ). Roedd y newid hwn yn y mutant byd-eang della yn ganlyniad i gynnydd yn amlder onglau 80-90 ° (34.71% yn erbyn 24.55%) ac, i raddau llai, onglau 70-80 ° (23.78% yn erbyn 20.18%), hy, sy'n cyfateb i raniadau celloedd traws (Ffig. 6c). Mae amlder nad ydynt yn traws adrannau (0-60 °) hefyd yn is yn y byd-eang della mutant ( Ffig. 6 c ). Mae amlder y rhaniadau cell ardraws ei gynyddu'n sylweddol yn y SAM y della mutant byd-eang (Ffig. 6 b). Roedd amlder rhaniadau celloedd traws yn yr IPR hefyd yn uwch yn y mutant byd-eang della o'i gymharu â'r math gwyllt (Ffig. 6d). Y tu allan i'r rhanbarth IPR, roedd gan y math gwyllt ddosbarthiad mwy unffurf o onglau rhannu celloedd, tra bod y della mutant byd-eang yn ffafrio rhaniadau tangential fel yr IPR (Ffig. 6e). Fe wnaethom hefyd feintioli cyfeiriadedd rhaniadau celloedd yn SAM o ga2 oxidase (ga2ox) mutants pumawd (ga2ox1-1, ga2ox2-1, ga2ox3-1, ga2ox4-1, a ga2ox6-2), cefndir mutant GA-anweithredol lle mae GA yn cronni. Yn gyson â'r cynnydd mewn lefelau GA, roedd SAM y pumawd ga2ox inflorescence mutant yn fwy na Col-0 (Ffig Atodol 12a, b), ac o'i gymharu â Col-0, dangosodd y pumedolyn ga2ox SAM ddosraniad gwahanol iawn o onglau cellraniad, gyda'r amledd ongl yn cynyddu o 50° i 90° yn ffafrio rhaniad entialie F. 12a–c). Felly, rydym yn dangos bod actifadu cyfansoddol signalau GA a chroniad GA yn achosi rhaniadau celloedd ochrol yn yr IPR a gweddill y SAM.
a, b Delweddu 3D o haen L1 Ler (a) lliw PI a della mutant byd-eang (b) SAM gan ddefnyddio microsgopeg confocal. Mae cellfuriau newydd a ffurfiwyd yn yr SAM (ond nid y primordium) dros gyfnod o 10-h yn cael eu dangos a'u lliwio yn ôl eu gwerthoedd ongl. Mae'r mewnosodiad yn dangos y SAM ar 0 h. Mae'r bar lliw yn cael ei arddangos yn y gornel dde isaf. Mae'r saeth yn (b) yn pwyntio at enghraifft o ffeiliau celloedd wedi'u halinio yn y della mutant byd-eang. Ailadroddwyd yr arbrawf ddwywaith gyda chanlyniadau tebyg. ce cymhariaeth o ddosbarthiad amledd cyfeiriadedd planau cellraniad yn y SAM(d), IPR(e), a non-IPR(f) rhwng Ler a global della. Cafwyd gwerthoedd P gan ddefnyddio prawf dwy gynffon Kolmogorov-Smirnov. f, g Delweddu 3D o ddelweddau confocal o SAM wedi'i staenio gan PI o Col-0 (i) a pCUC2::gai-1-VENUS (j) planhigion trawsenynnol. Mae paneli (a, b) yn dangos cellfuriau newydd (ond nid primordia) a ffurfiwyd yn yr Heneb Restredig o fewn 10 h. Ailadroddwyd yr arbrawf ddwywaith gyda chanlyniadau tebyg. h–j Cymharu dosraniad amledd cyfeiriadedd plân rhaniad celloedd sydd wedi'u lleoli yn yr holl SAM(h), IPR (i) a heb fod yn IPR (j) rhwng planhigion Col-0 a pCUC2::gai-1-VENUS. Cafwyd gwerthoedd P gan ddefnyddio prawf dwy gynffon Kolmogorov-Smirnov.
Nesaf, gwnaethom brofi effaith atal signalau GA yn benodol yn yr IPR. I'r perwyl hwn, defnyddiwyd hyrwyddwr cwpan cotyledon 2 (CUC2) i ysgogi mynegiant o brotein gai-1 negyddol trech wedi'i asio i VENUS (yn y llinell pCUC2::gai-1-VENUS). Yn yr SAM math gwyllt, mae hyrwyddwr CUC2 yn gyrru mynegiant y mwyafrif o IPRs yn yr SAM, gan gynnwys celloedd ffin, o P4 ymlaen, a gwelwyd mynegiant penodol tebyg yn pCUC2:: planhigion gai-1-VENUS (gweler isod). Nid oedd dosbarthiad onglau cellraniad ar draws SAM neu IPR planhigion pCUC2::gai-1-VENUS yn sylweddol wahanol i ddosbarthiad y math gwyllt, er yn annisgwyl canfuom fod celloedd heb IPR yn y planhigion hyn yn rhannu ar amledd uwch o 80–90° (Ffig. 6f–j).
Awgrymwyd bod cyfeiriad cellraniad yn dibynnu ar geometreg yr SAM, yn enwedig y straen tynnol a gynhyrchir gan y crymedd meinwe46. Gofynnwyd felly a oedd siâp yr SAM wedi'i newid yn y planhigion della mutant global a pCUC2::gai-1-VENUS. Fel yr adroddwyd yn flaenorol12, roedd maint yr SAM mutant byd-eang della yn fwy na'r math gwyllt (Ffig Atodol 13a, b, d). Cadarnhaodd hybridization in situ o CLV3 a STM RNA yr ehangiad meristem mewn della mutants a dangosodd ymhellach ehangiad ochrol y gilfach bôn-gelloedd (Ffig Atodol 13e, f, h, i). Fodd bynnag, roedd crymedd SAM yn debyg yn y ddau genoteip (Ffig Atodol 13k, m, n, p). Gwelsom gynnydd tebyg mewn maint yn y mutant pedwarplyg gai-t6 rga-t2 rgl1-1 rgl2-1 della heb newid yn y crymedd o'i gymharu â'r math gwyllt (Ffig Atodol 13c, d, g, j, l, o, p). Effeithiwyd ar amlder cyfeiriadedd cellraniad hefyd yn y mutant pedwarplyg della, ond i raddau llai nag yn y mutant della monolithig (Ffig Atodol 12d-f). Mae'r effaith dos hon, ynghyd â diffyg effaith ar grymedd, yn awgrymu bod gweithgaredd RGL3 gweddilliol yn y mutant pedwarplyg Della yn cyfyngu ar newidiadau mewn cyfeiriadedd rhaniad celloedd a achosir gan golli gweithgaredd DELLA a bod newidiadau mewn rhaniadau cell ochrol yn digwydd mewn ymateb i newidiadau mewn gweithgaredd signalau GA yn hytrach na newidiadau mewn geometreg SAM. Fel y disgrifiwyd uchod, mae'r hyrwyddwr CUC2 yn gyrru mynegiant IPR yn y SAM gan ddechrau ar P4 (Ffig Atodol 14a, b), ac mewn cyferbyniad, roedd gan y pCUC2::gai-1-VENUS SAM lai o faint ond crymedd uwch (Ffig Atodol 14c-h). Gall y newid hwn ym morffoleg pCUC2::gai-1-VENUS SAM arwain at ddosbarthiad gwahanol o bwysau mecanyddol o'i gymharu â'r math gwyllt, lle mae straen cylchedol uchel yn cychwyn ar bellter byrrach o'r ganolfan SAM47. Fel arall, gall y newidiadau ym morffoleg pCUC2::gai-1-VENUS SAM ddeillio o newidiadau mewn priodweddau mecanyddol rhanbarthol a achosir gan fynegiant trawsgen48. Yn y ddau achos, gallai hyn wrthbwyso'n rhannol effeithiau newidiadau mewn signalau GA trwy gynyddu'r tebygolrwydd y bydd celloedd yn rhannu yn y cyfeiriadedd cylchedol/trawsnewidiol, gan esbonio ein harsylwadau.
Gyda'i gilydd, mae ein data'n cadarnhau bod signalau GA uwch yn chwarae rhan weithredol yng nghyfeiriad ochrol yr awyren cellraniad yn yr IPR. Maent hefyd yn dangos bod crymedd meristem hefyd yn dylanwadu ar ogwydd yr awyren cellraniad yn yr IPR.
Mae cyfeiriadedd traws yr awyren rhannu yn yr IPR, oherwydd gweithgaredd signalau GA uchel, yn awgrymu bod GA yn rhag-drefnu ffeil celloedd rheiddiol yn yr epidermis o fewn yr SAM i ddiffinio'r sefydliad cellog a geir yn ddiweddarach yn y internode epidermaidd. Yn wir, roedd ffeiliau celloedd o'r fath i'w gweld yn aml mewn delweddau SAM o mutants byd-eang della (Ffig. 6b). Felly, i archwilio ymhellach swyddogaeth ddatblygiadol patrwm gofodol signalau GA yn yr SAM, defnyddiwyd delweddu treigl amser i ddadansoddi trefniadaeth ofodol celloedd yn yr IPR mewn planhigion math gwyllt (Ler a Col-0), della byd-eang, a pCUC2:: gai-1-VENUS planhigion trawsenynnol.
Canfuom fod qmRGA yn dangos bod gweithgarwch signalau GA yn yr IPR wedi cynyddu o P1/P2 ac wedi cyrraedd uchafbwynt ar P4, ac arhosodd y patrwm hwn yn gyson dros amser (Ffig. 4a–f a Ffig Atodol 8c–f, k). Er mwyn dadansoddi trefniadaeth ofodol celloedd yn yr IPR gyda signal GA cynyddol, gwnaethom labelu celloedd IPR Ler uwchben ac i ochrau P4 yn ôl eu tynged datblygiadol a ddadansoddwyd 34 h ar ôl arsylwi cyntaf, hy, mwy na dwy waith plastid, gan ganiatáu inni ddilyn celloedd IPR yn ystod datblygiad primordium o P1 / P2 i P4. Defnyddiasom dri lliw gwahanol: melyn ar gyfer y celloedd hynny a gafodd eu hintegreiddio i'r primordium ger P4, gwyrdd ar gyfer y rhai a oedd yn yr IPR, a phorffor ar gyfer y rhai a gymerodd ran yn y ddwy broses (Ffig. 7a–c). Ar t0 (0 h), roedd haenau 1-2 o gelloedd IPR i'w gweld o flaen P4 (Ffig. 7a). Yn ôl y disgwyl, pan ymrannodd y celloedd hyn, gwnaethant hynny'n bennaf trwy'r plân rhaniad traws (Ffig. 7a–c). Cafwyd canlyniadau tebyg gan ddefnyddio Col-0 SAM (gan ganolbwyntio ar P3, y mae ei ffin yn plygu'n debyg i P4 yn Ler), er yn y genoteip hwn roedd y plyg a ffurfiwyd ar y ffin flodeuog yn cuddio'r celloedd IPR yn gyflymach (Ffig. 7g-i). Felly, mae patrwm rhannu celloedd IPR yn rhag-drefnu'r celloedd yn rhesi rheiddiol, fel mewn internodes. Mae trefniadaeth rhesi rheiddiol a lleoleiddio celloedd IPR rhwng organau olynol yn awgrymu bod y celloedd hyn yn epilyddion rhyngnodol.
Yma, rydym wedi datblygu biosynhwyrydd signalau GA gymharebmetrig, qmRGA, sy'n caniatáu mapio meintiol o weithgaredd signalau GA sy'n deillio o grynodiadau derbynyddion GA a GA cyfun tra'n lleihau ymyrraeth â llwybrau signalau mewndarddol, a thrwy hynny ddarparu gwybodaeth am swyddogaeth GA ar y lefel gellog. I'r perwyl hwn, gwnaethom adeiladu protein DELLA wedi'i addasu, mRGA, sydd wedi colli'r gallu i rwymo partneriaid rhyngweithio DELLA ond sy'n parhau i fod yn sensitif i broteolysis a achosir gan GA. Mae qmRGA yn ymateb i newidiadau alldarddol ac mewndarddol mewn lefelau GA, ac mae ei briodweddau synhwyro deinamig yn galluogi asesu newidiadau ysbeidiol mewn gweithgaredd signalau GA yn ystod datblygiad. Mae qmRGA hefyd yn offeryn hyblyg iawn oherwydd gellir ei addasu i feinweoedd gwahanol trwy newid yr hyrwyddwr a ddefnyddir ar gyfer ei fynegiant (os oes angen), ac o ystyried natur warchodedig llwybr signalau GA a motiff PFYRE ar draws angiospermau, mae'n debygol o fod yn drosglwyddadwy i rywogaethau eraill22. Yn gyson â hyn, dangoswyd bod treiglad cyfatebol yn y protein SLR1 DELLA reis (HYY497AAA) hefyd yn atal gweithgaredd atalydd twf SLR1 tra'n lleihau ychydig ar ei ddiraddiad trwy gyfrwng GA, tebyg i mRGA23. Yn nodedig, dangosodd astudiaethau diweddar mewn Arabidopsis fod treiglad asid amino sengl yn y parth PFYRE (S474L) wedi newid gweithgaredd trawsgrifio RGA heb effeithio ar ei allu i ryngweithio â phartneriaid ffactor trawsgrifio50. Er bod y treiglad hwn yn agos iawn at y 3 amnewidiad asid amino sy'n bresennol yn mRGA, mae ein hastudiaethau'n dangos bod y ddau dreiglad hyn yn newid nodweddion gwahanol DELLA. Er bod y rhan fwyaf o bartneriaid ffactor trawsgrifio yn rhwymo i barthau LHR1 a SAW yn DELLA26,51, gall rhai asidau amino cadw yn y parth PFYRE helpu i sefydlogi'r rhyngweithiadau hyn.
Mae datblygiad internode yn nodwedd allweddol mewn pensaernïaeth planhigion a gwella cynnyrch. Datgelodd qmRGA weithgarwch signalau GA uwch mewn celloedd rhagnodydd internode IPR. Trwy gyfuno delweddu meintiol a geneteg, dangoswyd bod patrymau signalau GA yn arosod awyrennau cellraniad cylchol/traws yn yr epidermis SAM, gan siapio'r sefydliad cellraniad sydd ei angen ar gyfer datblygiad internode. Mae nifer o reoleiddwyr cyfeiriadedd planau cellraniad wedi'u nodi yn ystod datblygiad52,53. Mae ein gwaith yn rhoi enghraifft glir o sut mae gweithgarwch signalau GA yn rheoleiddio'r paramedr cellog hwn. Gall DELLA ryngweithio â chymhlygion protein sy'n plygu ymlaen llaw41, felly gall signalau GA reoleiddio cyfeiriadedd awyren cellraniad trwy ddylanwadu'n uniongyrchol ar gyfeiriadedd microtiwbyn cortigol40,41,54,55. Fe wnaethom ddangos yn annisgwyl, yn SAM, nad oedd cydberthynas gweithgaredd signalau GA uwch yn ymestyn neu rannu celloedd, ond dim ond anisotropi twf, sy'n gyson ag effaith uniongyrchol GA ar gyfeiriad rhaniad celloedd yn yr IPR. Fodd bynnag, ni allwn eithrio y gallai'r effaith hon fod yn anuniongyrchol hefyd, er enghraifft wedi'i chyfryngu gan feddalu cellfuriau a achosir gan GA56. Mae newidiadau mewn priodweddau cellfuriau yn achosi straen mecanyddol57,58, a all hefyd ddylanwadu ar gyfeiriadedd yr awyren cellraniad trwy effeithio ar gyfeiriadedd microtiwbwlau cortigol39,46,59. Gall effeithiau cyfunol straen mecanyddol a achosir gan GA a rheoleiddio cyfeiriadedd microtiwbyn yn uniongyrchol gan GA fod yn gysylltiedig â chynhyrchu patrwm penodol o gyfeiriadedd rhaniad celloedd yn yr IPR i ddiffinio internodes, ac mae angen astudiaethau pellach i brofi'r syniad hwn. Yn yr un modd, mae astudiaethau blaenorol wedi amlygu pwysigrwydd y proteinau TCP14 a 15 sy’n rhyngweithio â DELLA wrth reoli ffurfiant internod60,61 a gallai’r ffactorau hyn gyfryngu gweithrediad GA ynghyd â BREVIPEDICELLUS (BP) a PENNYWISE (PNY), sy’n rheoleiddio datblygiad internode ac y dangoswyd eu bod yn dylanwadu ar signalau GA2,62. O ystyried bod DELLAs yn rhyngweithio â llwybrau signalau brassinosteroid, ethylene, asid jasmonig, ac asid abssisig63,64 ac y gall yr hormonau hyn ddylanwadu ar gyfeiriadedd microtiwb65, gall hormonau eraill hefyd gyfryngu effeithiau GA ar gyfeiriadedd cellraniad.
Dangosodd astudiaethau sytolegol cynnar fod angen rhanbarthau mewnol ac allanol yr SAM Arabidopsis ar gyfer datblygiad internod2,42. Mae'r ffaith bod GA yn rheoleiddio rhaniad celloedd yn weithredol yn y meinweoedd mewnol12 yn cefnogi swyddogaeth ddeuol GA wrth reoleiddio maint meristem a internode yn y SAM. Mae patrwm rhannu cyfeiriadol celloedd hefyd yn cael ei reoleiddio'n dynn yn y meinwe SAM mewnol, ac mae'r rheoliad hwn yn hanfodol ar gyfer twf coesyn52. Bydd yn ddiddorol archwilio a yw GA hefyd yn chwarae rhan wrth gyfeirio'r awyren cellraniad yn y sefydliad SAM mewnol, a thrwy hynny yn cydamseru manyleb a datblygiad internodes o fewn y SAM.
Tyfwyd planhigion mewn vitro mewn pridd neu gyfrwng 1x Murashige-Skoog (MS) (Duchefa) wedi'i ategu â swcros 1% ac 1% agar (Sigma) o dan amodau safonol (golau 16 h, 22 ° C), ac eithrio arbrofion hypocotyl a thwf gwreiddiau lle tyfwyd eginblanhigion ar blatiau fertigol o dan olau cyson a 22 ° C. Ar gyfer arbrofion nitrad, tyfwyd planhigion ar gyfrwng MS wedi'i addasu (cyfrwng planhigion bioWORLD) wedi'i ategu â nitrad digonol (0 neu 10 mM KNO3), 0.5 mM NH4-succinate, 1% swcros ac 1% A-agar (Sigma) o dan amodau diwrnod hir.
Ailgyfunwyd GID1a cDNA a fewnosodwyd yn pDONR221 â pDONR P4-P1R-pUBQ10 a pDONR P2R-P3-mCherry i pB7m34GW i gynhyrchu pUBQ10::GID1a-mCherry. Ailgyfunwyd DNA IDD2 a fewnosodwyd i pDONR221 yn pB7RWG266 i gynhyrchu p35S: IDD2-RFP. Er mwyn cynhyrchu pGID1b:: 2xmTQ2-GID1b, chwyddwyd darn 3.9 kb i fyny'r afon o ranbarth codio GID1b a darn 4.7 kb yn cynnwys y GID1b cDNA (1.3 kb) a'r terfynwr (3.4 kb) yn gyntaf gan ddefnyddio'r paent preimio yn Nhabl Atodol 3 ac yna PDNR1P4-derfynol wedi'i fewnosod yn Nhabl Atodol 3 ac yna PDNR1P4. pDONR P2R-P3 (Thermo Fisher Scientific), yn y drefn honno, ac yn olaf ailgyfuno â pDONR221 2xmTQ268 i mewn i'r fector targed pGreen 012567 gan ddefnyddio clonio Porth. I gynhyrchu pCUC2::LSSmOrange, casglwyd y dilyniant hyrwyddwr CUC2 (3229 bp i fyny'r afon o ATG) a ddilynwyd gan ddilyniant codio mOrange mawr wedi'i symud gan Stokes (LSSmOrange)69 gyda signal lleoleiddio niwclear N7 a therfynwr trawsgrifio NOS i'r system pGreen kanamycin targedu fector-fector3 gan ddefnyddio'r system mewnfector targedu kanamycin3. Cyflwynwyd y fector deuaidd planhigion i straen Agrobacterium tumefaciens GV3101 a'i gyflwyno i ddail Nicotiana benthamiana trwy ddull ymdreiddio Agrobacterium ac i Arabidopsis thaliana Col-0 trwy ddull dip blodau, yn y drefn honno. pUBQ10::qmRGA pUBQ10::GID1a-mCherry a pCLV3::mCherry-NLS Roedd qmRGA wedi'u hynysu oddi wrth epil F3 ac F1 y croesau priodol, yn y drefn honno.
Perfformiwyd hybrideiddio RNA in situ ar flaenau saethu tua 1 cm o hyd72, a gasglwyd ac a osodwyd ar unwaith mewn hydoddiant FAA (3.7% fformaldehyd, 5% asid asetig, 50% ethanol) wedi'i oeri ymlaen llaw i 4 °C. Ar ôl triniaethau gwactod 2 × 15 munud, newidiwyd y gosodiad a deorwyd samplau dros nos. Cafodd cDNAs GID1a, GID1b, GID1c, GAI, RGL1, RGL2, a RGL3 a stilwyr antisense i'w 3′-UTR eu syntheseiddio gan ddefnyddio'r paent preimio a ddangosir yn Nhabl Atodol 3 fel y disgrifiwyd gan Rosier et al.73. Cafodd stilwyr â label digoxigenin eu canfod gan ddefnyddio gwrthgyrff digoxigenin (gwanhad 3000-plyg; Roche, rhif catalog: 11 093 274 910), a chafodd adrannau eu staenio â ffosffad 5-bromo-4-chloro-3-indolyl (BCIP, gwanediad 250-plyg) / BTtrozni tetra-bluetra-250-plyg (BTtrozni tetra-bluetra-250-plyg), gwanhau) ateb.
Amser postio: Chwefror-10-2025