Yn yr astudiaeth hon, effeithiau ysgogol y driniaeth gyfunol orheoleiddwyr twf planhigionYmchwiliwyd i nanoronynnau (2,4-D a chinetin) a ocsid haearn (Fe₃O₄-NPs) ar forffogenesis in vitro a chynhyrchu metabolyn eilaidd yn *Hypericum perforatum* L. Gwellodd y driniaeth wedi'i optimeiddio [2,4-D (0.5 mg/L) + cinetin (2 mg/L) + Fe₃O₄-NPs (4 mg/L)] baramedrau twf y planhigyn yn sylweddol: cynyddodd uchder y planhigyn 59.6%, hyd y gwreiddiau 114.0%, nifer y blagur 180.0%, a phwysau ffres y callws 198.3% o'i gymharu â'r grŵp rheoli. Gwellodd y driniaeth gyfunol hon hefyd effeithlonrwydd adfywio (50.85%) a chynyddodd y cynnwys hypericin 66.6%. Datgelodd dadansoddiad GC-MS gynnwys uchel o hyperoside, β-patholene, ac alcohol cetyl, gan gyfrif am 93.36% o gyfanswm arwynebedd y brig, tra bod cynnwys cyfanswm y ffenolau a'r flavonoidau wedi cynyddu cymaint â 80.1%. Mae'r canlyniadau hyn yn dangos bod rheoleiddwyr twf planhigion (PGRs) a nanoronynnau Fe₃O₄ (Fe₃O₄-NPs) yn cael effaith synergaidd trwy ysgogi organogenesis a chronni cyfansoddion bioactif, sy'n cynrychioli strategaeth addawol ar gyfer gwella biodechnolegol planhigion meddyginiaethol.
Mae llysiau Sant Ioan (Hypericum perforatum L.), a elwir hefyd yn lysiau Sant Ioan, yn blanhigyn llysieuol lluosflwydd o'r teulu Hypericaceae sydd â gwerth economaidd.[1] Mae ei gydrannau bioactif posibl yn cynnwys taninau naturiol, xanthonau, phloroglucinol, naphthalenedianthrone (hyperin a pseudohyperin), flavonoidau, asidau ffenolaidd, ac olewau hanfodol.[2,3,4] Gellir lluosogi llysiau Sant Ioan trwy ddulliau traddodiadol; fodd bynnag, mae tymhoroldeb dulliau traddodiadol, egino hadau isel, a thueddiad i glefydau yn cyfyngu ar ei botensial ar gyfer tyfu ar raddfa fawr a ffurfio metabolion eilaidd yn barhaus.[1,5,6]
Felly, ystyrir bod diwylliant meinwe in vitro yn ddull effeithiol ar gyfer lluosogi planhigion yn gyflym, cadwraeth adnoddau germplasm, a chynyddu cynnyrch cyfansoddion meddyginiaethol [7, 8]. Mae rheoleiddwyr twf planhigion (PGRs) yn chwarae rhan hanfodol wrth reoleiddio morffogenesis ac maent yn angenrheidiol ar gyfer tyfu callws ac organebau cyfan in vitro. Mae optimeiddio eu crynodiadau a'u cyfuniadau yn hanfodol ar gyfer cwblhau'r prosesau datblygiadol hyn yn llwyddiannus [9]. Felly, mae deall cyfansoddiad a chrynodiad priodol rheoleiddwyr yn bwysig ar gyfer gwella twf a chynhwysedd adfywiol llysiau Sant Ioan (H. perforatum) [10].
Mae nanoronynnau ocsid haearn (Fe₃O₄) yn ddosbarth o nanoronynnau sydd wedi cael eu datblygu neu sy'n cael eu datblygu ar gyfer diwylliant meinwe. Mae gan Fe₃O₄ briodweddau magnetig sylweddol, biogydnawsedd da, a'r gallu i hyrwyddo twf planhigion a lleihau straen amgylcheddol, felly mae wedi denu sylw sylweddol mewn dyluniadau diwylliant meinwe. Gall cymwysiadau posibl y nanoronynnau hyn gynnwys optimeiddio diwylliant in vitro i hyrwyddo rhaniad celloedd, gwella amsugno maetholion, ac actifadu ensymau gwrthocsidiol [11].
Er bod nanoronynnau wedi dangos effeithiau hyrwyddo da ar dwf planhigion, mae astudiaethau ar gymhwysiad cyfunol nanoronynnau Fe₃O₄ a rheoleiddwyr twf planhigion wedi'u optimeiddio yn *H. perforatum* yn brin o hyd. I lenwi'r bwlch gwybodaeth hwn, gwerthusodd yr astudiaeth hon effeithiau eu heffeithiau cyfunol ar forffogenesis in vitro a chynhyrchu metabolyn eilaidd i ddarparu mewnwelediadau newydd ar gyfer gwella nodweddion planhigion meddyginiaethol. Felly, mae gan yr astudiaeth hon ddau amcan: (1) optimeiddio crynodiad rheoleiddwyr twf planhigion i hyrwyddo ffurfio callws, adfywio egin, a gwreiddio yn effeithiol in vitro; a (2) gwerthuso effeithiau nanoronynnau Fe₃O₄ ar baramedrau twf in vitro. Mae cynlluniau ar gyfer y dyfodol yn cynnwys gwerthuso cyfradd goroesi planhigion wedi'u hadfywio yn ystod y cyfnod cynefino (in vitro). Disgwylir y bydd canlyniadau'r astudiaeth hon yn gwella effeithlonrwydd micropropagation *H. perforatum* yn sylweddol, a thrwy hynny'n cyfrannu at ddefnydd cynaliadwy a chymwysiadau biotechnolegol y planhigyn meddyginiaethol pwysig hwn.
Yn yr astudiaeth hon, cawsom ddail allblanhigion o blanhigion llysiau Sant Ioan blynyddol a dyfwyd yn y cae (planhigion mam). Defnyddiwyd yr allblanhigion hyn i optimeiddio amodau diwylliant in vitro. Cyn eu tyfu, rinsiwyd y dail yn drylwyr o dan ddŵr distyll rhedegog am sawl munud. Yna diheintiwyd arwynebau'r allblanhigion trwy eu trochi mewn ethanol 70% am 30 eiliad, ac yna eu trochi mewn toddiant sodiwm hypoclorit 1.5% (NaOCl) yn cynnwys ychydig ddiferion o Tween 20 am 10 munud. Yn olaf, rinsiwyd yr allblanhigion dair gwaith â dŵr distyll di-haint cyn eu trosglwyddo i'r cyfrwng diwylliant nesaf.
Dros y pedair wythnos nesaf, mesurwyd paramedrau adfywio egin, gan gynnwys y gyfradd adfywio, nifer yr egin fesul allblaniad, a hyd yr egin. Pan gyrhaeddodd yr egin wedi'u hadfywio hyd o leiaf 2 cm, cawsant eu trosglwyddo i gyfrwng gwreiddio yn cynnwys cyfrwng MS hanner cryfder, 0.5 mg/L o asid indolebutyrig (IBA), a 0.3% o gwm guar. Parhaodd y diwylliant gwreiddio am dair wythnos, ac yn ystod y cyfnod hwnnw mesurwyd y gyfradd gwreiddio, nifer y gwreiddiau, a hyd y gwreiddiau. Ailadroddwyd pob triniaeth dair gwaith, gyda 10 allblaniad yn cael eu tyfu fesul ailadrodd, gan gynhyrchu tua 30 o allblaniadau fesul triniaeth.
Mesurwyd uchder y planhigyn mewn centimetrau (cm) gan ddefnyddio pren mesur, o waelod y planhigyn i flaen y ddeilen dalaf. Mesurwyd hyd y gwreiddyn mewn milimetrau (mm) yn syth ar ôl tynnu'r eginblanhigion yn ofalus a chael gwared ar y cyfrwng tyfu. Cyfrifwyd nifer y blagur fesul allblanhigyn yn uniongyrchol ar bob planhigyn. Mesurwyd nifer y smotiau duon ar y dail, a elwir yn nodau, yn weledol. Credir bod y nodau duon hyn yn chwarennau sy'n cynnwys hypericin, neu smotiau ocsideiddiol, ac fe'u defnyddir fel dangosydd ffisiolegol o ymateb y planhigyn i driniaeth. Ar ôl tynnu'r holl gyfrwng tyfu, mesurwyd pwysau ffres yr eginblanhigion gan ddefnyddio graddfa electronig gyda chywirdeb o filigramau (mg).
Dyma'r dull ar gyfer cyfrifo cyfradd ffurfio callws: ar ôl meithrin allblaniadau mewn cyfrwng sy'n cynnwys amrywiol reoleiddwyr twf (cinasau, 2,4-D, a Fe3O4) am bedair wythnos, cyfrifir nifer yr allblaniadau sy'n gallu ffurfio callws. Dyma'r fformiwla ar gyfer cyfrifo cyfradd ffurfio callws:
Ailadroddwyd pob triniaeth dair gwaith, gydag o leiaf 10 allblaniad yn cael eu harchwilio ym mhob ailadrodd.
Mae'r gyfradd adfywio yn adlewyrchu cyfran y meinwe callws sy'n cwblhau'r broses wahaniaethu blagur yn llwyddiannus ar ôl y cam ffurfio callws. Mae'r dangosydd hwn yn dangos gallu meinwe callws i drawsnewid yn feinwe wahaniaethol a thyfu'n organau planhigion newydd.
Y cyfernod gwreiddio yw'r gymhareb o nifer y canghennau sy'n gallu gwreiddio i gyfanswm y canghennau. Mae'r dangosydd hwn yn adlewyrchu llwyddiant y cyfnod gwreiddio, sy'n hanfodol mewn micro-luosogi a lluosogi planhigion, gan fod gwreiddio da yn helpu eginblanhigion i oroesi'n well mewn amodau tyfu.
Echdynnwyd cyfansoddion hypericin gyda 90% methanol. Ychwanegwyd hanner cant mg o ddeunydd planhigion sych at 1 ml o methanol a'i soniceiddio am 20 munud ar 30 kHz mewn glanhawr uwchsonig (model A5120-3YJ) ar dymheredd ystafell yn y tywyllwch. Ar ôl soniceiddio, cafodd y sampl ei allgyrchu ar 6000 rpm am 15 munud. Casglwyd yr uwchnofiant, a mesurwyd amsugnedd hypericin ar 592 nm gan ddefnyddio sbectroffotomedr Plus-3000 S yn ôl y dull a ddisgrifiwyd gan Conceiçao et al. [14].
Ni wnaeth y rhan fwyaf o driniaethau gyda rheoleiddwyr twf planhigion (PGRs) a nanoronynnau ocsid haearn (Fe₃O₄-NPs) achosi ffurfio nodwlau du ar ddail egin wedi'u hadfywio. Ni welwyd unrhyw nodwlau yn unrhyw un o'r triniaethau gyda 0.5 neu 1 mg/L o 2,4-D, 0.5 neu 1 mg/L o kinetin, neu 1, 2, neu 4 mg/L o nanoronynnau ocsid haearn. Dangosodd ychydig o gyfuniadau gynnydd bach yn natblygiad nodwlau (ond nid yn ystadegol arwyddocaol) ar grynodiadau uwch o kinetin a/neu nanoronynnau ocsid haearn, megis y cyfuniad o 2,4-D (0.5–2 mg/L) gyda kinetin (1–1.5 mg/L) a nanoronynnau ocsid haearn (2–4 mg/L). Dangosir y canlyniadau hyn yn Ffigur 2. Mae nodwlau du yn cynrychioli chwarennau sy'n llawn hypericin, sy'n digwydd yn naturiol ac yn fuddiol. Yn yr astudiaeth hon, roedd nodau du yn gysylltiedig yn bennaf â brownio meinweoedd, gan ddangos amgylchedd ffafriol ar gyfer cronni hypericin. Hyrwyddodd triniaeth â nanoronynnau 2,4-D, kinetin, a Fe₃O₄ dwf callws, lleihau brownio, a chynyddu cynnwys cloroffyl, gan awgrymu gwell swyddogaeth metabolig a gostyngiad posibl mewn difrod ocsideiddiol [37]. Gwerthusodd yr astudiaeth hon effeithiau kinetin ar y cyd â nanoronynnau 2,4-D a Fe₃O₄ ar dwf a datblygiad callws llysiau Sant Ioan (Ffig. 3a–g). Mae astudiaethau blaenorol wedi dangos bod gan nanoronynnau Fe₃O₄ weithgareddau gwrthffyngol a gwrthficrobaidd [38, 39] a, phan gânt eu defnyddio ar y cyd â rheoleiddwyr twf planhigion, gallant ysgogi mecanweithiau amddiffyn planhigion a lleihau mynegeion straen cellog [18]. Er bod biosynthesis metabolion eilaidd yn cael ei reoleiddio'n enetig, mae eu cynnyrch gwirioneddol yn ddibynnol iawn ar amodau amgylcheddol. Gall newidiadau metabolaidd a morffolegol ddylanwadu ar lefelau metabolyn eilaidd trwy reoleiddio mynegiant genynnau planhigion penodol ac ymateb i ffactorau amgylcheddol. Ar ben hynny, gall anwythyddion sbarduno actifadu genynnau newydd, sydd yn eu tro yn ysgogi gweithgaredd ensymatig, gan actifadu llwybrau biosynthetig lluosog yn y pen draw ac arwain at ffurfio metabolion eilaidd. Ar ben hynny, dangosodd astudiaeth arall fod lleihau cysgodi yn cynyddu amlygiad i olau haul, a thrwy hynny'n codi tymereddau yn ystod y dydd yng nghynefin naturiol *Hypericum perforatum*, sydd hefyd yn cyfrannu at gynnyrch hypericin cynyddol. Yn seiliedig ar y data hyn, ymchwiliodd yr astudiaeth hon i rôl nanoronynnau haearn fel anwythyddion posibl mewn diwylliant meinwe. Dangosodd y canlyniadau y gall y nanoronynnau hyn actifadu genynnau sy'n ymwneud â biosynthesis hesperidin trwy ysgogiad ensymatig, gan arwain at gronni cynyddol y cyfansoddyn hwn (Ffig. 2). Felly, o'i gymharu â phlanhigion sy'n tyfu o dan amodau naturiol, gellir dadlau y gellir gwella cynhyrchu cyfansoddion o'r fath in vivo hefyd pan gyfunir straen cymedrol ag actifadu genynnau sy'n ymwneud â biosynthesis metabolion eilaidd. Yn gyffredinol, mae triniaethau cyfunol yn cael effaith gadarnhaol ar y gyfradd adfywio, ond mewn rhai achosion, mae'r effaith hon yn cael ei gwanhau. Yn arbennig, gallai triniaeth gydag 1 mg/L o 2,4-D, 1.5 mg/L o ginase, a chrynodiadau gwahanol gynyddu'r gyfradd adfywio yn annibynnol ac yn sylweddol o 50.85% o'i gymharu â'r grŵp rheoli (Ffig. 4c). Mae'r canlyniadau hyn yn awgrymu y gall cyfuniadau penodol o nanohormonau weithredu'n synergaidd i hyrwyddo twf planhigion a chynhyrchu metabolynau, sydd o arwyddocâd mawr ar gyfer diwylliant meinwe planhigion meddyginiaethol. Dangosodd Palmer a Keller [50] y gallai triniaeth 2,4-D ysgogi ffurfio callws yn annibynnol yn St. perforatum, tra bod ychwanegu kinase wedi gwella ffurfio a adfywio callws yn sylweddol. Roedd yr effaith hon oherwydd gwelliant mewn cydbwysedd hormonaidd ac ysgogiad rhaniad celloedd. Canfu Bal et al. [51] y gallai triniaeth Fe₃O₄-NP wella swyddogaeth ensymau gwrthocsidiol yn annibynnol, a thrwy hynny hyrwyddo twf gwreiddiau yn St. perforatum. Gwellodd cyfryngau diwylliant yn cynnwys nanoronynnau Fe₃O₄ ar grynodiadau o 0.5 mg/L, 1 mg/L, ac 1.5 mg/L gyfradd adfywio planhigion llin [52]. Gwellodd y defnydd o nanoronynnau kinetin, 2,4-dichlorobenzothiazolinone, a Fe₃O₄ y cyfraddau ffurfio callws a gwreiddiau yn sylweddol, fodd bynnag, mae angen ystyried sgîl-effeithiau posibl defnyddio'r hormonau hyn ar gyfer adfywio in vitro. Er enghraifft, gall defnydd hirdymor neu grynodiad uchel o 2,4-dichlorobenzothiazolinone neu kinetin arwain at amrywiad clonal somatig, straen ocsideiddiol, morffoleg callws annormal, neu wydreiddio. Felly, nid yw cyfradd adfywio uchel o reidrwydd yn rhagweld sefydlogrwydd genetig. Dylid asesu pob planhigyn sydd wedi'i adfywio gan ddefnyddio marcwyr moleciwlaidd (e.e. RAPD, ISSR, AFLP) neu ddadansoddiad cytogenetig i bennu eu homogenedd a'u tebygrwydd i blanhigion in vivo [53,54,55].
Dangosodd yr astudiaeth hon am y tro cyntaf y gall y defnydd cyfunol o reoleiddwyr twf planhigion (2,4-D a chinetin) gyda nanoronynnau Fe₃O₄ wella morffogenesis a chronni metabolion bioactif allweddol (gan gynnwys hypericin a hyperoside) yn *Hypericum perforatum*. Nid yn unig y gwnaeth y regimen triniaeth wedi'i optimeiddio (1 mg/L 2,4-D + 1 mg/L cinetin + 4 mg/L Fe₃O₄-NPs) wneud y mwyaf o ffurfio callws, organogenesis, a chynnyrch metabolyn eilaidd ond dangosodd hefyd effaith ysgogol ysgafn, a allai wella goddefgarwch straen a gwerth meddyginiaethol y planhigyn. Mae'r cyfuniad o nanotechnoleg a diwylliant meinwe planhigion yn darparu llwyfan cynaliadwy ac effeithlon ar gyfer cynhyrchu cyfansoddion meddyginiaethol in vitro ar raddfa fawr. Mae'r canlyniadau hyn yn paratoi'r ffordd ar gyfer cymwysiadau diwydiannol ac ymchwil yn y dyfodol i fecanweithiau moleciwlaidd, optimeiddio dos a chywirdeb genetig, a thrwy hynny gysylltu ymchwil sylfaenol ar blanhigion meddyginiaethol â biodechnoleg ymarferol.
Amser postio: 12 Rhagfyr 2025