Y cyffur anthelmintig N, N-diethyl-m-toluamid (DEET) wedi cael ei adrodd i atal AChE (acetylcholinesterase) ac mae ganddo briodweddau carcinogenig posibl oherwydd fasgwlareiddio gormodol. Yn y papur hwn, rydym yn dangos bod DEET yn benodol yn ysgogi celloedd endothelaidd sy'n hyrwyddo angiogenesis, a thrwy hynny gynyddu twf tiwmor. Mae DEET yn actifadu prosesau cellog sy'n arwain at angiogenesis, gan gynnwys amlhau, mudo, ac adlyniad. Mae hyn yn gysylltiedig â chynhyrchiad NO cynyddol a mynegiant VEGF mewn celloedd endothelaidd. Diddymwyd yr holl effeithiau hyn trwy dawelu M3 neu ddefnyddio atalyddion ffarmacolegol M3, gan awgrymu bod angiogenesis a achosir gan DEET yn sensitif i M3. Mae arbrofion sy'n cynnwys signalau calsiwm mewn celloedd endothelaidd a HEK sy'n gorfynegi derbynyddion M3, yn ogystal ag astudiaethau rhwymo a thocio, yn dangos bod DEET yn gweithredu fel modulator allosteric o dderbynyddion M3. Ar ben hynny, mae DEET yn atal AChE, a thrwy hynny gynyddu bio-argaeledd asetylcoline a'i rwymo i dderbynyddion M3, a gwella effeithiau proangiogenig trwy reoleiddio allosteric.
Roedd ECs cynradd wedi'u hynysu o aorta llygod y Swistir. Addaswyd y dull echdynnu o brotocol Kobayashi 26 . Cafodd Murine ECs eu meithrin mewn cyfrwng EBM-2 wedi'i ategu gan FBS wedi'i anactifadu gan wres o 5% tan y pedwerydd darn.
Dadansoddwyd effaith dau grynodiad o DEET ar ymlediad HUVEC, U87MG, neu BF16F10 gan ddefnyddio Pecyn Assay Amlediad Celloedd CyQUANT (Probes Moleciwlaidd, C7026). Yn gryno, cafodd 5.103 o gelloedd y ffynnon eu hadu mewn plât 96-ffynnon, eu caniatáu i'w hatodi dros nos, ac yna eu trin â DEET am 24 h. Ar ôl tynnu'r cyfrwng twf, ychwanegwch hydoddiant rhwymo llifyn at bob ffynnon o'r microplate a deorwch y celloedd ar 37 ° C am 30 munud. Pennwyd lefelau fflworoleuedd gan ddefnyddio darllenydd microplate amlfodd Mithras LB940 (Berthold Technologies, Bad Wildbad, yr Almaen) gyda hidlwyr cyffro 485 nm a hidlwyr allyriadau 530 nm.
Cafodd HUVEC eu hadu mewn platiau 96-ffynnon ar ddwysedd o 104 o gelloedd y ffynnon. Cafodd celloedd eu trin â DEET am 24 h. Aseswyd hyfywedd celloedd gan ddefnyddio assay MTT lliwimetrig (Sigma-Aldrich, M5655). Cafwyd gwerthoedd dwysedd optegol ar ddarllenydd microplate amlfodd (Mithras LB940) ar donfedd o 570 nm.
Astudiwyd effeithiau DEET gan ddefnyddio profion angiogenesis in vitro. Cynyddodd triniaeth gyda 10-8 M neu 10-5 M DEET ffurfio hyd capilari mewn HUVECs (Ffig. 1a, b, bariau gwyn). O'i gymharu â'r grŵp rheoli, dangosodd triniaeth gyda chrynodiadau DEET yn amrywio o 10-14 i 10-5 M fod hyd y capilari wedi cyrraedd llwyfandir yn 10-8 M DEET (Ffig Atodol S2). Ni ddarganfuwyd unrhyw wahaniaeth arwyddocaol yn effaith proangiogenig in vitro HUVECs a gafodd eu trin â DEET yn yr ystod crynodiad o 10-8 M a 10-5 M.
Er mwyn pennu effaith DEET ar neofasgwlareiddio, fe wnaethom berfformio mewn astudiaethau neovascularization vivo. Ar ôl 14 diwrnod, llygod chwistrellu gyda celloedd endothelaidd precultured gyda 10-8 M neu 10-5 M DEET yn dangos cynnydd sylweddol yn cynnwys hemoglobin (Ffig. 1c, bariau gwyn).
Ar ben hynny, astudiwyd neofasgwlareiddio a achosir gan DEET mewn llygod sy'n cario xenograft U87MG a gafodd eu chwistrellu'n ddyddiol (ip) gyda DEET ar ddogn y gwyddys ei fod yn achosi crynodiadau plasma o 10-5 M, sy'n normal mewn bodau dynol agored. mewn 23. Gwelwyd tiwmorau canfyddadwy (hy tiwmorau >100 mm3) 14 diwrnod ar ôl chwistrellu celloedd U87MG i lygod. Ar ddiwrnod 28, roedd twf tiwmor wedi'i wella'n sylweddol mewn llygod a gafodd eu trin gan DEET o gymharu â llygod rheoli (Ffig. 1d, sgwariau). Ar ben hynny, dangosodd staen CD31 tiwmorau fod DEET wedi cynyddu arwynebedd capilari yn sylweddol ond nid dwysedd micro-len. (Ffig. 1e–g).
Er mwyn pennu rôl derbynyddion muscarinig mewn amlhau a achosir gan DETA, defnyddiwyd 10-8 M neu 10-5 M DETA ym mhresenoldeb pFHHSiD (10-7 M, antagonydd derbynnydd M3 dethol). Trin HUVEC. Roedd pFHHSiD yn rhwystro priodweddau ymledol DETA yn llwyr ym mhob crynodiad (Tabl 1).
O dan yr amodau hyn, gwnaethom hefyd archwilio a fyddai DEET yn cynyddu hyd capilari mewn celloedd HUVEC. Yn yr un modd, rhwystrodd pFHHSiD hyd capilari a achosir gan DEET yn sylweddol (Ffig. 1a, b, bariau llwyd). Ar ben hynny, perfformiwyd arbrofion tebyg gyda siRNA M3. Er nad oedd y siRNA rheolaeth yn effeithiol wrth hyrwyddo ffurfiad capilari, diddymodd tawelu'r derbynnydd muscarinig M3 allu DEET i gynyddu hyd capilari (Ffig. 1a, b, bariau du).
Ymhellach, cafodd fasgwlareiddio in vitro a achosir gan DEET 10-8 M neu 10-5 M eu rhwystro'n llwyr gan pFHHSiD (Ffig. 1c, d, cylchoedd). Mae'r canlyniadau hyn yn dangos bod DEET yn hyrwyddo angiogenesis trwy lwybr sy'n sensitif i wrthwynebwyr derbynnydd M3 dethol neu siRNA M3.
AChE yw targed moleciwlaidd DEET. Gall cyffuriau fel donepezil, sy'n gweithredu fel atalyddion AChE, ysgogi angiogenesis EC in vitro ac mewn modelau isgemia ym môl y llygoden14. Fe wnaethon ni brofi effaith dau grynodiad o DEET ar weithgaredd ensymau AChE yn HUVEC. Gostyngodd crynodiadau isel (10-8 M) ac uchel (10-5 M) o DEET weithgaredd AChE endothelaidd o'i gymharu ag amodau rheoli (Ffig. 2).
Roedd y ddau grynodiad o DEET (10-8 M a 10-5 M) yn lleihau gweithgaredd acetylcholinesterase ar HUVEC. Defnyddiwyd BW284c51 (10-5 M) fel rheolydd ar gyfer atalyddion acetylcholinesterase. Mynegir canlyniadau fel canran o weithgaredd AChE ar HUVEC a gafodd ei drin gyda'r ddau grynodiad o DEET o gymharu â chelloedd a drinnir gan gerbydau. Mynegir gwerthoedd fel cymedr ± SEM o chwe arbrawf annibynnol. *p < 0.05 o gymharu â rheolaeth (prawf cymharu lluosog Kruskal-Wallis a Dunn).
Mae ocsid nitrig (NO) yn cymryd rhan yn y broses angiogenig 33, felly, ni astudiwyd unrhyw gynhyrchiad mewn HUVECs a ysgogir gan DEET. Cynyddwyd cynhyrchiad RHIF endothelaidd a driniwyd gan DEET o'i gymharu â chelloedd rheoli, ond cyrhaeddodd arwyddocâd yn unig ar ddogn o 10-8 M (Ffig. 3c). Er mwyn pennu'r newidiadau moleciwlaidd sy'n rheoli cynhyrchiad NO a achosir gan DEET, dadansoddwyd mynegiant ac actifadu eNOS gan blotio Gorllewinol. Er na wnaeth triniaeth DEET newid mynegiant eNOS, cynyddodd ffosfforyleiddiad eNOS yn sylweddol yn ei safle actifadu (Ser-1177) tra'n lleihau ei safle ataliol (Thr-495) o'i gymharu â chelloedd heb eu trin mewn ffosfforyleiddiad eNOS (Ffig. 3d). At hynny, cyfrifwyd cymhareb eNOS ffosfforylaidd yn y safle actifadu a'r safle ataliol ar ôl normaleiddio faint o eNOS ffosfforylaidd i gyfanswm yr ensym. Cynyddwyd y gymhareb hon yn sylweddol mewn HUVECs a gafodd eu trin gyda phob crynodiad o DEET o'i gymharu â chelloedd heb eu trin (Ffig. 3d).
Yn olaf, dadansoddwyd mynegiant VEGF, un o'r prif ffactorau proangiogenig, gan blotio'r Gorllewin. Cynyddodd DEET fynegiad VEGF yn sylweddol, tra rhwystrodd pFHHSiD y mynegiad hwn yn llwyr .
Gan fod effeithiau DEET yn sensitif i rwystr ffarmacolegol a dadreoleiddio derbynyddion M3, gwnaethom brofi'r ddamcaniaeth y gallai DEET wella signalau calsiwm. Yn syndod, methodd DEET â chynyddu calsiwm cytoplasmig yn HUVEC (data heb ei ddangos) a HEK/M3 (Ffig. 4a, b) ar gyfer y ddau grynodiad a ddefnyddiwyd.
Amser postio: Rhagfyr-30-2024