Y cyffur gwrthlyngyrol N,N-diethyl-m-toluamid (DEET) wedi cael ei adrodd i atal AChE (asetylcholinesterase) ac mae ganddo briodweddau carsinogenig posibl oherwydd fasgwlareiddio gormodol. Yn yr erthygl hon, rydym yn dangos bod DEET yn ysgogi celloedd endothelaidd yn benodol sy'n hyrwyddo angiogenesis, a thrwy hynny'n cynyddu twf tiwmor. Mae DEET yn actifadu prosesau cellog sy'n arwain at angiogenesis, gan gynnwys amlhau, mudo, ac adlyniad. Mae hyn yn gysylltiedig â chynhyrchiad NO a mynegiant VEGF cynyddol mewn celloedd endothelaidd. Diddymodd tawelu M3 neu ddefnyddio atalyddion ffarmacolegol M3 yr holl effeithiau hyn, gan awgrymu bod angiogenesis a achosir gan DEET yn sensitif i M3. Mae arbrofion sy'n cynnwys signalau calsiwm mewn celloedd endothelaidd a HEK sy'n gorfynegi derbynyddion M3, yn ogystal ag astudiaethau rhwymo a docio, yn dangos bod DEET yn gweithredu fel modiwleiddiwr alosterig o dderbynyddion M3. Ar ben hynny, mae DEET yn atal AChE, a thrwy hynny'n cynyddu bioargaeledd asetylcholine a'i rwymo i dderbynyddion M3, ac yn gwella effeithiau proangiogenig trwy reoleiddio alosterig.
Ynysigwyd ECs cynradd o aorta llygod Swistir. Addaswyd y dull echdynnu o brotocol Kobayashi 26. Tyfuwyd ECs murine mewn cyfrwng EBM-2 wedi'i ategu â 5% o FBS wedi'i ddadactifadu â gwres tan y bedwaredd basiad.
Dadansoddwyd effaith dau grynodiad o DEET ar amlhau HUVEC, U87MG, neu BF16F10 gan ddefnyddio'r Pecyn Asesu Amlhau Celloedd CyQUANT (Molecular Probes, C7026). Yn gryno, hauwyd 5.103 o gelloedd fesul ffynnon mewn plât 96-ffynnon, a ganiatawyd iddynt lynu dros nos, ac yna eu trin â DEET am 24 awr. Ar ôl tynnu'r cyfrwng twf, ychwanegwch doddiant rhwymo llifyn at bob ffynnon o'r microplât a deorwch y celloedd ar 37 °C am 30 munud. Penderfynwyd lefelau fflwroleuedd gan ddefnyddio darllenydd microplât aml-fodd Mithras LB940 (Berthold Technologies, Bad Wildbad, yr Almaen) a oedd â hidlwyr cyffroi 485 nm a hidlwyr allyriadau 530 nm.
Hadwyd HUVEC mewn platiau 96-ffynnon ar ddwysedd o 104 celloedd fesul pydnon. Cafodd celloedd eu trin â DEET am 24 awr. Aseswyd hyfywedd celloedd gan ddefnyddio assay MTT colorimetrig (Sigma-Aldrich, M5655). Cafwyd gwerthoedd dwysedd optegol ar ddarllenydd microplatiau amlfodd (Mithras LB940) ar donfedd o 570 nm.
Astudiwyd effeithiau DEET gan ddefnyddio asesiadau angiogenesis in vitro. Cynyddodd triniaeth â 10-8 M neu 10-5 M DEET ffurfio hyd capilarïau mewn HUVECs (Ffig. 1a, b, bariau gwyn). O'i gymharu â'r grŵp rheoli, dangosodd triniaeth â chrynodiadau DEET yn amrywio o 10-14 i 10-5 M fod hyd y capilarïau wedi cyrraedd llwyfandir ar 10-8 M DEET (Ffig. Atodol S2). Ni chanfuwyd unrhyw wahaniaeth arwyddocaol yn effaith proangiogenig in vitro HUVECs a gafodd eu trin â DEET yn yr ystod crynodiad o 10-8 M a 10-5 M.
Er mwyn pennu effaith DEET ar neofasgwlareiddio, fe wnaethom gynnal astudiaethau neofasgwlareiddio in vivo. Ar ôl 14 diwrnod, dangosodd llygod a gafodd chwistrelliad â chelloedd endothelaidd wedi'u cyn-ddiwyllio â 10-8 M neu 10-5 M DEET gynnydd sylweddol yng nghynnwys haemoglobin (Ffig. 1c, bariau gwyn).
Ar ben hynny, astudiwyd neofasgwlareiddio a achosir gan DEET mewn llygod â xenograft U87MG a gafodd eu chwistrellu'n ddyddiol (ip) â DEET ar ddos y gwyddys ei fod yn ysgogi crynodiadau plasma o 10-5 M, sy'n normal mewn bodau dynol a oedd wedi'u hamlygu. mewn 23. Gwelwyd tiwmorau canfyddadwy (h.y. tiwmorau >100 mm3) 14 diwrnod ar ôl chwistrellu celloedd U87MG i lygod. Ar ddiwrnod 28, roedd twf tiwmor wedi gwella'n sylweddol mewn llygod a gafodd eu trin â DEET o'i gymharu â llygod rheoli (Ffig. 1d, sgwariau). Ar ben hynny, dangosodd staenio CD31 tiwmorau fod DEET wedi cynyddu arwynebedd capilarïau yn sylweddol ond nid dwysedd microlestri. (Ffig. 1e–g).
I bennu rôl derbynyddion mwscarinig mewn amlhau a achosir gan DETA, defnyddiwyd 10-8 M neu 10-5 M DETA ym mhresenoldeb pFHHSiD (10-7 M, gwrthwynebydd derbynnydd M3 dethol). Triniaeth HUVEC. Rhwystrodd pFHHSiD briodweddau amlhau DETA yn llwyr ym mhob crynodiad (Tabl 1).
O dan yr amodau hyn, fe wnaethom hefyd archwilio a fyddai DEET yn cynyddu hyd capilarïau mewn celloedd HUVEC. Yn yr un modd, roedd pFHHSiD yn atal hyd capilarïau a achosir gan DEET yn sylweddol (Ffig. 1a, b, bariau llwyd). Ar ben hynny, perfformiwyd arbrofion tebyg gyda siRNA M3. Er nad oedd y siRNA rheoli yn effeithiol wrth hyrwyddo ffurfio capilarïau, diddymodd tawelu'r derbynnydd mwscarinig M3 allu DEET i gynyddu hyd capilarïau (Ffig. 1a, b, bariau du).
Ar ben hynny, cafodd fasgwlareiddio in vitro a neofasgwlareiddio in vivo a achosir gan DEET 10-8 M neu 10-5 M eu rhwystro'n llwyr gan pFHHSiD (Ffig. 1c, d, cylchoedd). Mae'r canlyniadau hyn yn dangos bod DEET yn hyrwyddo angiogenesis trwy lwybr sy'n sensitif i wrthwynebwyr derbynyddion M3 dethol neu siRNA M3.
AChE yw targed moleciwlaidd DEET. Gall cyffuriau fel donepezil, sy'n gweithredu fel atalyddion AChE, ysgogi angiogenesis EC in vitro ac mewn modelau isgemia aelodau ôl llygoden14. Profon ni effaith dau grynodiad o DEET ar weithgaredd ensym AChE yn HUVEC. Gostyngodd crynodiadau isel (10-8 M) ac uchel (10-5 M) o DEET weithgaredd AChE endothelaidd o'i gymharu ag amodau rheoli (Ffig. 2).
Gostyngodd y ddau grynodiad o DEET (10-8 M a 10-5 M) weithgaredd asetylcholinesteras ar HUVEC. Defnyddiwyd BW284c51 (10-5 M) fel rheolydd ar gyfer atalyddion asetylcholinesteras. Mynegir canlyniadau fel canran o weithgaredd AChE ar HUVEC a gafodd eu trin â'r ddau grynodiad o DEET o'i gymharu â chelloedd a gafodd eu trin â cherbyd. Mynegir gwerthoedd fel cymedr ± SEM o chwe arbrawf annibynnol. *p < 0.05 o'i gymharu â'r rheolydd (prawf cymhariaeth lluosog Kruskal-Wallis a Dunn).
Mae ocsid nitrig (NO) yn rhan o'r broses angiogenig 33, felly, astudiwyd cynhyrchiad NO mewn HUVECs wedi'u hysgogi gan DEET. Cynyddwyd cynhyrchiad NO endothelaidd wedi'i drin â DEET o'i gymharu â chelloedd rheoli, ond dim ond ar ddos o 10-8 M y cyrhaeddodd arwyddocâd (Ffig. 3c). I bennu'r newidiadau moleciwlaidd sy'n rheoli cynhyrchiad NO a achosir gan DEET, dadansoddwyd mynegiant ac actifadu eNOS trwy Western blotting. Er na newidiodd triniaeth DEET fynegiant eNOS, cynyddodd ffosfforyleiddiad eNOS yn sylweddol yn ei safle actifadu (Ser-1177) wrth leihau ei safle ataliol (Thr-495) o'i gymharu â chelloedd heb eu trin mewn ffosfforyleiddiad eNOS (Ffig. 3d). Ar ben hynny, cyfrifwyd y gymhareb o eNOS ffosfforyleiddiedig yn y safle actifadu a'r safle ataliol ar ôl normaleiddio faint o eNOS ffosfforyleiddiedig i gyfanswm yr ensym. Cynyddwyd y gymhareb hon yn sylweddol mewn HUVECs wedi'u trin â phob crynodiad o DEET o'i gymharu â chelloedd heb eu trin (Ffig. 3d).
Yn olaf, dadansoddwyd mynegiant VEGF, un o'r prif ffactorau pro-angiogenig, trwy Western blotting. Cynyddodd DEET fynegiant VEGF yn sylweddol, tra bod pFHHSiD wedi rhwystro'r mynegiant hwn yn llwyr.
Gan fod effeithiau DEET yn sensitif i rwystr ffarmacolegol a lleihau nifer y derbynyddion M3, fe wnaethom brofi'r ddamcaniaeth y gallai DEET wella signalau calsiwm. Yn syndod, methodd DEET â chynyddu calsiwm cytoplasmig yn HUVEC (data heb ei ddangos) a HEK/M3 (Ffig. 4a, b) ar gyfer y ddau grynodiad a ddefnyddiwyd.
Amser postio: 30 Rhagfyr 2024