Mae plaladdwyr yn chwarae rhan hanfodol wrth fynd i'r afael â phrinder bwyd byd-eang a mynd i'r afael â chlefydau dynol a gludir gan fectorau. Fodd bynnag, mae'r broblem gynyddol o wrthwynebiad i blaladdwyr yn gofyn am ddarganfod cyfansoddion newydd ar frys sy'n targedu targedau sydd heb eu defnyddio'n ddigonol. Gall sianeli potensial derbynnydd dros dro pryfed (TRPV)—Nanzhong (Nan) ac anactif (Iav)—ffurfio sianeli heterologaidd (Nan-Iav) a lleoleiddio i organau mecanosynhwyraidd sy'n cyfryngu geotropiaeth, clyw, a phroprioception mewn pryfed. Mae rhai plaladdwyr, fel aphidopyrrolidone (AP), yn targedu Nan-Iav trwy fecanweithiau anhysbys. Mae AP yn effeithiol yn erbyn pryfed sy'n sugno trwy dyllu (hemipterans), gan atal bwydo trwy amharu ar swyddogaeth y ffilamentau. Dim ond i Nan y gall AP rwymo, ond dim ond Nan-Iav all ryngweithio ag agonistiau, gan gynnwys nicotinamid endogenaidd (NAM), a thrwy hynny arddangos gweithgaredd sianel. Er gwaethaf potensial Nan-Iav fel targed pryfleiddiad, ychydig a wyddys am ei gydosodiad sianel, safleoedd rhwymo rheoleiddiol, a rheoleiddio sy'n ddibynnol ar Ca2+, gan rwystro datblygiad pryfleiddiad pellach. Yn yr astudiaeth hon, defnyddiwyd microsgopeg cryo-electron i bennu strwythur Nan-Iav mewn pryfed Hemiptera yn y cyflwr heb calmodulin-ligand, yn ogystal ag AP a NAM ar ffin y parth cytoplasmig ailadroddus ankyrin (ARD). Yn syndod, gwelsom y gall y protein Nan ei hun ffurfio pentamer, sy'n cael ei sefydlogi gan ryngweithiadau ARD a gyfryngir gan AP. Mae'r astudiaeth hon yn datgelu rhyngweithiadau moleciwlaidd rhwng pryfleiddiaid ac agonistiau a Nan-Iav, gan amlygu pwysigrwydd ARD mewn swyddogaeth a chydosod sianeli, ac archwilio mecanwaith rheoleiddio Ca2+.
Yn erbyn cefndir newid hinsawdd byd-eang cynyddol ddifrifol, mae dirywiad mewn diogelwch bwyd byd-eang yn un o brif heriau'r 21ain ganrif, gyda chanlyniadau rhaeadru i gymdeithas.1,2Mae adroddiad Cyflwr Diogelwch Bwyd a Maeth yn y Byd 2023 (SOFI) Sefydliad Iechyd y Byd yn amcangyfrif bod tua 2.33 biliwn o bobl ledled y byd yn dioddef o ansicrwydd bwyd cymedrol i ddifrifol, problem hirhoedlog.3,4Yn anffodus, amcangyfrifir bod 20% i 30% neu fwy o gynnyrch cnydau yn cael ei golli bob blwyddyn i blâu a phathogenau, a disgwylir i gynhesu byd-eang waethygu ymwrthedd i blâu a gwendid cnydau.4,5,6,7,8Mae datblygu plaladdwyr yn hanfodol nid yn unig i amddiffyn cnydau rhag plâu a lleihau lledaeniad pathogenau a gludir gan fectorau, ond hefyd i frwydro yn erbyn clefydau dynol a gludir gan fectorau fel twymyn dengue, malaria, a chlefyd Chagas, sy'n gynyddol wrthsefyll plaladdwyr.5,9,10,11
Ymhlith prif dargedau pryfleiddiaid niwrotocsig, mae'r sianel TRPV heterotetramerig Nanchung (Nan)-Anactif (Iav) yn cynrychioli dosbarth o dargedau pryfleiddiaid a ddarganfuwyd yn ystod y degawd diwethaf yn unig, gan gynnwys pryfleiddiaid sydd ar gael yn fasnachol fel imidacloprid a pyraclostrobin.12,13,14Mae'r pryfleiddiad lled-synthetig aphidopyrrolifen (AP) yn gynnyrch a ddatblygwyd a masnacheiddiwyd yn ddiweddar y mae ei brif gydran yn bryfleiddiad gweithredol Inscalis®, sy'n rhwymo AP ar lefel gweithgaredd is-nanomolar.15Mae AP yn arddangos gwenwyndra acíwt isel i beillwyr, pryfed buddiol, ac organebau eraill nad ydynt yn darged, a phan gaiff ei ddefnyddio yn unol â chyfarwyddiadau'r label, gall leihau pwysau ymwrthedd i bryfleiddiaid eraill.16,17,18Mae Nan ac Iav wedi'u dosbarthu'n eang ar draws rhywogaethau pryfed, dim ond mewn niwronau derbynnydd ymestyn cordaidd yr antenâu a'r aelodau y cânt eu cyd-fynegi, ac maent yn hanfodol ar gyfer clywed, canfyddiad disgyrchiant, a phropriodepryd.13,16,19,20,21,22Mae AP, imidacloprid, a pyraclostrobin yn ysgogi'r cymhlyg Nan-Iav trwy fecanwaith unigryw, gan atal trawsgludiad signal proprioceptive yn y pen draw.13,16,23Mewn pryfed sy'n sugno tyllu (hemipterans) fel llyslau a phryfed gwynion, mae colli propriosepsiwn yn amharu ar eu gallu i fwydo, gan arwain yn y pen draw at farwolaeth.13,24Yn ddiddorol, mae AP yn dangos affinedd uchel ar gyfer y cymhlyg Nan-Iav ac affinedd isel ar gyfer Nan yn unig. Mae rhwymo AP i Nan-Iav yn achosi cerrynt trydanol, ond nid yw rhwymo i Nan yn unig yn ysgogi gweithgaredd sianel. Nid yw Iav ei hun yn rhwymo i AP o gwbl.16Mae hyn yn awgrymu y gallai Nan ac Iav rwymo i ffurfio cyfadeiladau sianel Nan-Iav gwahanol (e.e., gyda chymhareb stoichiometreg gwahanol neu drefniadau gwahanol o fewn yr un gymhareb stoichiometreg) neu y gallai AP rwymo i sawl safle. Ar ben hynny, mae'r agonist naturiol nicotinamid (NAM) yn rhwymo i Drosophila Nan-Iav gydag affinedd micromolar, gan arddangos effeithiau tebyg i rai llyslau (AP) in vitro.16,25ac atal atgenhedlu a bwydo llyslau, gan arwain yn y pen draw at eu marwolaeth25,26Mae'r data hyn yn codi llawer o gwestiynau. Er enghraifft, mae'n parhau i fod yn aneglur sut mae'r heterodimer Nan-Iav yn cael ei ffurfio, pa safleoedd rhwymo a ddefnyddir i fodiwleiddio moleciwlau bach, a sut mae'r moleciwlau bach hyn yn rheoleiddio swyddogaeth sianel trwy atal proprioception. Ar ben hynny, mae'r rhesymau pam mae Nan ei hun yn anactif ac mae ganddo affinedd isel ar gyfer AP, tra bod yr heterodimer Nan-Iav yn weithredol ac yn rhwymo AP gydag affinedd uwch, yn parhau i fod yn aneglur. Yn olaf, ychydig a wyddys am y rheoleiddio Ca2+-ddibynnol ar swyddogaeth Nan-Iav a sut mae'n cael ei integreiddio i brosesau signalau niwronaidd.. 13,21
Yn yr astudiaeth hon, gan gyfuno microsgopeg cryo-electron, electroffisioleg, a thechnegau rhwymo radioligand, fe wnaethom egluro cydosodiad Nan-Iav a mecanwaith ei rwymo i reoleiddwyr moleciwl bach. Ar ben hynny, fe wnaethom ganfod calmodulin (CaM) wedi'i rwymo'n gyfansoddol i Iav a phentamerau Nan wedi'u sefydlogi ag AP. Mae'r canlyniadau hyn yn rhoi cipolwg pwysig ar reoleiddio ïonau calsiwm mewn sianeli, cydosod sianeli, a'r ffactorau sy'n pennu affinedd rhwymo ligand. Yn bwysicach fyth, fe wnaethom gadarnhau bod ARD yn chwarae rhan ganolog yn y prosesau hyn. Ein hastudiaeth o sianeli pryfed cyflawn wedi'u rhwymo i blaladdwyr amaethyddol perthnasol27, 28, 29yn agor rhagolygon ar gyfer datblygu'r diwydiant plaladdwyr, gan wella effeithiolrwydd a phenodoldeb plaladdwyr, a galluogi cymhwyso cyfansoddion sy'n targedu TRPV i rywogaethau eraill i fynd i'r afael â diogelwch bwyd byd-eang a lledaeniad clefydau a gludir gan fectorau.
Fe wnaethon ni hefyd ganfod bod Nan-Iav yn cael ei reoleiddio gan Ca2+, a bod y mecanwaith rheoleiddio yn cael ei gyfryngu gan CaM sydd wedi'i rwymo'n gyfansoddol. Yn bwysig, mae'r rheoleiddio Nav hwn sy'n ddibynnol ar Ca2+ gan CaM yn wahanol iawn i fecanweithiau rheoleiddio sianeli ïon eraill (e.e., sianeli Na+ foltedd-gatiedig a sianeli TRPV5/6)52,53,54,55,56,57Yn sianel Nav1.2, mae parth C-derfynol CaM yn cysylltu'n helical â'r parth C-derfynol (CTD), ac mae Ca2+ yn ysgogi rhwymo ei barth N-derfynol i ran distal y CTD.56Yn y sianel TRPV5/6, mae parth C-derfynol CaM yn rhwymo i CTH, ac mae Ca2+ yn ysgogi estyniad i fyny o'i barth N-derfynol i'r mandwll, gan rwystro athreiddedd cationau.53,54Rydym yn cynnig model ar gyfer swyddogaeth Nan-Iav-CaM a reoleiddir gan Ca2+ (Ffig. 4h). Yn y model hwn, mae parth N-derfynol CaM yn rhwymo'n gyfansoddol i barth C-derfynol (CTH) Iav. Yn y cyflwr gorffwys (crynodiad [Ca2+] isel), mae parth C-derfynol CaM yn rhyngweithio â Nan, gan sefydlogi cyfluniad yr ARD a thrwy hynny hyrwyddo agor sianel. Mae rhwymo agonist/pryfleiddiad i'r sianel yn achosi agor mandyllau, gan arwain at fewnlifiad Ca2+. Yna mae Ca2+ yn rhwymo i CaM, gan achosi daduniad y parth C-derfynol o ARD Nan. Gan fod blocio rhwymo CaM yn dileu effaith ataliol Ca2+ yn y bôn, mae'r daduniad hwn yn modiwleiddio symudedd ARD, a thrwy hynny'n achosi ataliad neu ddadsensiteiddio sy'n ddibynnol ar Ca2+. Mae adferiad cyflym ceryntau sianel ar ôl elution ïon calsiwm (Ffig. 4g) yn awgrymu bod y mecanwaith hwn yn hwyluso ymatebion cyflym i signalau niwronaidd a gyfryngir gan Ca2+. Ar ben hynny, adroddwyd bod rhanbarth C-derfynol Iav, sydd heb ei ddeall yn dda o hyd, yn chwarae rolau eraill wrth dargedu sianeli a rheoleiddio cyfredol.21
Yn olaf, mae ein hastudiaeth yn cyflwyno strwythur cydraniad uchel cymhleth sianel TRP pryfleiddiad-pryfladdwyr o bwys amaethyddol—darganfyddiad nad oeddem yn gwybod amdano o'r blaen. Yn arbennig, fe wnaethom nodweddu strwythur a swyddogaeth sianel y pryfed mewn celloedd dynol (HEK293S GnTi–) yn hytrach nag mewn celloedd pryfed. Yn wyneb ymwrthedd cynyddol i bryfleiddiaid a phwysau parhaus ar ddiogelwch bwyd a phathogenau, mae ein gwaith yn darparu gwybodaeth bwysig a fydd yn hwyluso datblygiad pryfleiddiaid newydd er budd iechyd pobl a diogelwch bwyd byd-eang. Mae astudiaethau wedi dangos bod pryfleiddiaid fel AP yn effeithiol yn erbyn rhai plâu pan gânt eu defnyddio yn unol â chyfarwyddiadau'r label ac mae ganddynt wenwyndra acíwt isel i beillwyr buddiol, gan ddangos eu diogelwch amgylcheddol.13,16Ar ben hynny, mae profion ar rai deilliadau AP ar fosgitos wedi dangos eu bod yn y pen draw yn colli eu gallu i hedfan. Bydd deall sut mae'r cyfansoddion modiwleiddio hyn yn rhwymo i Nan-Iav yn hwyluso addasu cyfansoddion presennol neu ddatblygu cyfansoddion newydd ar gyfer mwy effeithiol amanwl gywirrheoli plâu. Mae ein hastudiaeth yn dangos bod rhyngwyneb ARD Nan-Iav yn hanfodol nid yn unig ar gyfer rheoleiddio gweithgaredd cyfansoddion mewndarddol, plaladdwyr, a Ca2+-CaM, ond hefyd ar gyfer cydosod sianeli. Rydym yn awgrymu y gallai amharu ar gydosod heterodimer gyda moleciwlau bach fod yn ddull unigryw ac addawol ar gyfer datblygu atalyddion sianeli ïon.
O'r wyth genyn orthologaidd, dewiswyd genynnau hyd llawn y chwilod brown (Halyomorpha halys) Nanchung ac Inactive, gan arddangos sefydlogrwydd rhagorol mewn glanedyddion. Cafodd y genynnau a syntheseiddiwyd eu optimeiddio ar gyfer codonau ar gyfer mynegiant dynol a'u clonio i'r fector pBacMam pCMV-DEST (Life Technologies) gan ddefnyddio safleoedd cyfyngu XhoI ac EcoRI. Sicrhaodd hyn fod y clonau yn y ffrâm gyda'r tagiau C-derfynol GFP-FLAG-10xHis ac mCherry-FLAG-10xHis, sy'n cael eu hollti gan protease HRC-3C (PPX), gan ganiatáu annibynnolmynegiantY primerau a ddefnyddiwyd i glonio Nanchung ac Inactive i'r fector pBacMam oedd fel a ganlyn:
Cafwyd delweddau microsgopig o ronynnau unigol ar ficrosgop electron trosglwyddo (FEI) Titan Krios G2 wedi'i gyfarparu â chamera K3 a hidlydd ynni Gatan BioQuantum. Gweithredwyd y microsgop ar 300 keV, gyda gosodiad ynni o 20 eV, maint picsel sampl o 1.08 Å/picsel (chwyddiad enwol o 81,000x), a graddiant dadffocws yn amrywio o -0.8 i -2.2 μm. Perfformiwyd recordiad fideo ar 40 ffrâm yr eiliad gan ddefnyddio microsgop Latitude S (Gatan) gyda chyfradd dos enwol o 25 e–px−1 s−1, amser amlygiad o 2.4 eiliad, a chyfanswm dos o tua 60 e–Å−2.
Perfformiwyd cywiriad symudiad a achosir gan drawst a phwysoli dos ar ffilm gan ddefnyddio MotionCor2 yn RELION 4.061. Perfformiwyd amcangyfrif paramedr swyddogaeth trosglwyddo cyferbyniad (CTF) yn cryoSPARC gan ddefnyddio'r dull amcangyfrif CTF seiliedig ar glwtiau62. Cafodd micrograffau ffotogram gyda datrysiad ffitio CTF ≥4 Å eu heithrio o'r dadansoddiad dilynol. Yn nodweddiadol, defnyddiwyd is-set o 500–1000 o ficrograffau ffotogram ar gyfer dewis pwyntiau yn cryoSPARC, ac yna sawl rownd o ddosbarthu 2D ar ôl hidlo i gael delwedd gyfeirio glir ar gyfer dewis gronynnau seiliedig ar dempled. Yna echdynnwyd gronynnau gan ddefnyddio blychau ffin 64 picsel a binio 4-plyg. Perfformiwyd sawl rownd o ddosbarthu 2D i gael gwared ar gategorïau gronynnau diangen. Ail-grewyd y model 3D cychwynnol gan ddefnyddio ail-greu ab initio a'i fireinio gan ddefnyddio mireinio anunffurf yn cryoSPARC. Perfformiwyd dosbarthiad 3D yn cryoSPARC neu RELION yn seiliedig ar heterogenedd ARD. Ni welwyd unrhyw heterogenedd sylweddol o barthau pilen. Mireiniwyd gronynnau gan ddefnyddio'r dulliau C1 a C2; Ystyriwyd bod gronynnau â datrysiad C2 uwch yn gymesur o ran C2 a'u mewnforio i RELION ar gyfer mireinio Bayesaidd. Yna trosglwyddwyd y gronynnau yn ôl i cryoSPARC ar gyfer mireinio anghyson a lleol terfynol. Dangosir y datrysiad terfynol a chyfrifon y gronynnau yn Nhabl 1.
Wrth brosesu pentamerau Nan+AP, fe wnaethom archwilio amrywiol ddulliau ar gyfer gwella datrysiad parthau pilen (yn enwedig rhanbarth y mandwll), megis tynnu signal a mwgwd TMD. Fodd bynnag, methodd yr ymdrechion hyn oherwydd yr anhwylder eithafol posibl yn rhanbarth y mandwll a'r amrywioldeb cyffredinol yn y TMD. Cyfrifwyd y datrysiad terfynol gan ddefnyddio mwgwd a gynhyrchwyd yn awtomatig gan y dull prosesu anunffurf yn cryoSPARC, gan dargedu rhanbarth ARD yn bennaf. Cyflawnodd hyn ddatrysiad sylweddol uwch na datrysiad parthau'r pilen (yn enwedig rhanbarth VSLD).
Cynhyrchwyd modelau de novo cychwynnol o ffurfiau apo y bygiau Nanchung ac Anactif yn gyntaf gan ddefnyddio Coot63, a chynhyrchwyd modelau o'r bygiau Nan ac Iav gan ddefnyddio AlphaFold264 i nodi rhanbarthau hyder isel. Roedd modelu calmodulin yn seiliedig ar ffitio corff anhyblyg y modelau sy'n rhwymo Ca2+ a di-Ca2+ mewn derbyniadau PDB 4JPZ56 ac 1CFD65, yn y drefn honno. Mireiniwyd y modelau gan ddefnyddio mireinio sfferig i sicrhau'r stereocemeg gywir a geometreg dda. Yna modelwyd ffosffatidylcholin, ffosffatidylethanolamin, a ffosffatidylserin fel dwyseddau lipid wedi'u diffinio'n dda, a gosodwyd y ligandau NAM ac AP yn y dwyseddau cyfatebol yn y cyffyrdd tynn. Cynhyrchwyd ffeiliau cyfyngu o'r llinyn SMILES o'r isoffurfiau gan ddefnyddio eLBOW yn PHENIX66. Yn olaf, mireiniwyd y modelau mewn gofod go iawn yn PHENIX gan ddefnyddio chwiliad grid lleol a lleihau byd-eang gyda chyfyngiadau strwythur eilaidd. Defnyddiwyd y gweinydd MolProbity ar gyfer mireinio modelau a dadansoddi strwythurol, a pherfformiwyd darluniadau gan ddefnyddio PyMOL ac UCSF Chimera X. 67,68,69 Perfformiwyd dadansoddiad agorfa gan ddefnyddio'r gweinydd HOLE,70 a pherfformiwyd mapio cadwraeth dilyniant gan ddefnyddio'r gweinydd Consurf.71
Perfformiwyd dadansoddiad ystadegol gan ddefnyddio Igor Pro 6.2, Excel Office 365, a GraphPad Prism 7.0. Cyflwynir yr holl ddata meintiol fel cymedr ± gwall safonol (SEM). Defnyddiwyd prawf-t Myfyriwr (dwy-gynffon, heb ei baru) i gymharu dau grŵp. Defnyddiwyd dadansoddiad amrywiant unffordd (ANOVA) ac yna prawf ôl-hoc Dunnett i gymharu grwpiau lluosog. *P< 0.05, **P< 0.01, a ***PYstyriwyd bod < 0.001 yn ystadegol arwyddocaol yn dibynnu ar ddosbarthiad y data. Cyfrifwyd gwerthoedd Kd, Ki, a'u cyfyngau hyder anghymesur o 95% gan ddefnyddio GraphPad Prism 10.
Am fwy o fanylion am fethodoleg yr astudiaeth, gweler Crynodeb Adroddiad Portffolio Natur sydd wedi'i gysylltu yn yr erthygl hon.
Adeiladwyd y model cychwynnol gan ddefnyddio'r modelau calmodulin o gronfeydd data PDB 4JPZ ac 1CFD. Mae'r cyfesurynnau wedi'u hadneuo yn y Protein Data Bank (PDB) o dan y rhifau mynediad 9NVN (Nan-Iav-CaM heb ligand), 9NVO (Nan-Iav-CaM wedi'i rwymo i nicotinamid), 9NVP (Nan-Iav-CaM wedi'i rwymo i nicotinamid ac EDTA), 9NVQ (Nan-Iav-CaM wedi'i rwymo i aphenidolpyrrolline a chalsiwm), 9NVR (Nan-Iav-CaM wedi'i rwymo i aphenidolpyrrolline ac EDTA), a 9NVS (Nan pentamer wedi'i rwymo i aphenidolpyrrolline). Mae'r delweddau microsgopeg cryo-electron cyfatebol wedi'u hadneuo yn y Gronfa Ddata Microsgopeg Electron (EMDB) o dan y rhifau mynediad canlynol: EMD-49844 (Nan-Iav-CaM heb ligand), EMD-49845 (cyfadeiliad Nan-Iav-CaM gyda nicotinamid), EMD-49846 (cyfadeiliad Nan-Iav-CaM gyda nicotinamid ac EDTA), EMD-49847 (cyfadeiliad Nan-Iav-CaM gydag aphidopyrrolline a chalsiwm), EMD-49848 (cyfadeiliad Nan-Iav-CaM gydag aphidopyrrolline ac EDTA), ac EMD-49849 (cyfadeiliad Nan pentamer gydag aphidopyrrolline). Cyflwynir y data crai ar gyfer y dadansoddiad swyddogaethol yn y papur hwn.
Amser postio: Ion-28-2026